Анализатор пцр geneXpert Dx



Скачать 115.5 Kb.
Дата30.04.2016
Размер115.5 Kb.
ТипАнализ



Анализатор ПЦР GeneXpert Dx

Система GeneXpert Dx предназначена для проведения диагностики in vitro и включает автоматизированную очистку образцов, амплификацию нуклеиновых кислот и определение интересующей последовательности в простых или сложных образцах с использованием методов ПЦР в реальном времени и ПЦР с обратной транскриптазой. Система состоит из диагностического устройства, персонального компьютера, сканера штриховых кодов и программного обеспечения для проведения тестов и просмотра их результатов. Система требует использования одноразовых картриджей, содержащих реагенты для ПЦР, в которых и происходит реакция. Поскольку картриджи являются автономными, перекрестная контаминация образцов исключена. Результаты тестов предоставляются в графическом, табличном и цифровом форматах.

Прибор GeneXpert Dx оснащен независимыми амплификационными модулями, предназначенными для загрузки различных диагностических картриджей GeneXpert. После загрузки картриджа, прибор автоматически производит подготовку образца, амплификацию, обнаружение искомой последовательности нуклеиновой кислоты и предоставление результата.

Прибор GeneXpert Dx может содержать от 1 до 16 модулей, каждый модуль может обрабатывать одновременно один образец. До 4 приборов могут объединяться вместе, и подключаться к одному компьютеру в единую диагностическую систему. Так как GeneXpert Dx — система с произвольным доступом, можно использовать модули независимо друг от друга, обрабатывать разные образцы и производить разные типы анализов на одном приборе. Поддерживается одновременная обработка до 16 образцов в каждом приборе.



Основные преимущества системы GeneXpert:

  • простота и удобство в работе

  • высокая скорость получения результатов

  • автоматизированная подготовка образцов

  • высокая точность получаемых результатов

  • исключена контаминация на любой стадии работы прибора

  • система с произвольным доступом – возможность постановки теста в любое время

Типы используемых картриджей



  1. Тесты на MRSA и SA (Метициллинорезистентный Staphylococcus aureus и Staphylococcus aureus), являются качественными и количественными диагностическими тестами, проводимыми in vitro и разработанным для быстрого обнаружения устойчивых к метициллину штаммов Staphylococcus aureus в мазках из носа, образцах кожи и мягких тканей или из культуры крови.

Staphylococcus aureus является ведущим возбудителем нозокомиальных инфекций, который вызывает ряд заболеваний и часто приводит к смерти. К наиболее серьезным инфекциям, относятся бактериемия, пневмония, остеомиелит, острый эндокардит, инфекционно-токсический шок, пищевые отравления, миокардит, перикардит, энцефалит, менингит, абсцессы и некоторые другие заболевания. Резистентность стафилококков к оксациллину (метициллину) обусловлена наличием mecA – гена устойчивости. С клинической точки зрения важно дифференцировать резистентные штаммы стафилококков, поскольку терапия бета-лактамными антибиотиками будет неэффективна. Большинство MRSA штаммов часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков, за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин). Раннее начало адекватной антибактериальной терапии существенно улучшает результаты лечения.

Staphylococcus aureus является так-же наиболее распространенной причиной постхирургических инфекций в больницах. Колонизация стафилококками в несколько раз увеличивает риск послеоперационных хирургических инфекций. Не зная, кто из пациентов является носителем Staphylococcus aureus, перед чистой операцией, врачи не могут оптимально подготовить пациента.

С целью ограничения распространения этих инфекций были разработаны и внедрены в учреждениях здравоохранения США и Европы стратегии и методы контроля. Контроль MRSA является основной задачей программ инфекционного контроля в большинстве больниц.

В настоящее время стандартным способом наблюдения с целью обнаружения MRSA является выделение культуры, что достаточно трудоемко и требует больших затрат времени. Компанией «Cepheid», США разработаны быстрые и более чувствительные способы контроля MRSA, которые существенно усилят программы инфекционного контроля и помогут в рациональной антибиотикотерапии, что позволит сократить расходы на фармакологические препараты и уменьшит количество инфекционных осложнений.


Катриджи содержат реагенты для обнаружения MRSA, а также контроль обработки образца (SPC) для контроля за надлежащей обработкой целевых бактерий и наблюдения за наличием ингибиторов в реакции ПЦР. Функция проверки наличия зонда (PCC) служит для проверки регидратации реагента, размещения пробирки для ПЦР в картридже, целостности зонда и стабильности флуорофоров. Праймеры, используемые в тесте Xpert MRSA/SA, позволяют определить характерные последовательности стафилококкового протеина А (spa), ген резистентности к метициллину/оксациллину (mecA) и стафилококковую кассетную хромосому (SCCmec), встроенную в хромосомный сайт SA attB.
Тесты Xpert MRSA и Xpert MRSA/SA nasal – тесты для определения метициллинорезистентного Staphylococcus aureus и Staphylococcus aureus в мазках из носоглотки. Быстрое выявление позволит врачам оперативно принимать решения по деколонизации пациента для предотвращения хирургических раневых инфекций вызванных Staphylococcus aureus и Метициллинорезистентным Staphylococcus aureus.
Тест Xpert MRSA/SA BC - тест для определения метициллинорезистентного Staphylococcus aureus и Staphylococcus aureus в гемокультуре. Септицемия является главной причиной смертности в больницах. Staphylococcus aureus – один из двух наиболее распространенных патогенов, вызывающих бактериемии и сепсис у госпитализированных пациентов и лиц с внебольничной инфекцией.
Тест Xpert MRSA/SA SSTI - тест для определения метициллинорезистентного Staphylococcus aureus и Staphylococcus aureus в отделяемом при инфекциях кожи и мягких тканей. В последние годы, расходы на лечение инфекций кожи и мягких тканей постоянно росли параллельно с ростом резистентности к антибиотикам. Для проведения рациональной антибиотикотерапии врачи должны знать, инфицированы раны Staphylococcus aureus или Метициллинорезистентным Staphylococcus aureus.

Преимущества данного метода исследования:

  • высокочувствительный метод

  • получение результатов в короткий срок (около 50 мин.)

  1. Тест Xpert EV – тест для определения энтеровируса в образцах спинномозговой жидкости (СМЖ), предназначен для качественного обнаружения РНК энтеровируса (EV) в образцах СМЖ у пациентов с симптомами менингита. Многочисленные исследования доказали, что быстрое положительное подтверждение вирусного происхождения менингита сокращает расходы, помогая избежать ненужного лечения антибиотиками и сводя к минимуму пребывание в больнице.

Согласно таксономической классификации энтеровирус принадлежит к классу вирусов, состоящему из полиовирусов, вирусов Коксаки, эховирусов и энтеровирусов. Энтеровирусы являются причиной широкого ряда инфекций и наиболее часто передаются контактным путем с выделениями носоглотки инфицированных людей. Обычными симптомами являются жар, сильная головная боль, резь в глазах от яркого света, сонливость или спутанность, а также тошнота и рвота. У грудных детей симптомы включают в себя жар, раздражительность, трудности при просыпании или потерю аппетита. Пациентов с такими инфекциями часто госпитализируют, особенно детей.
Тест Xpert EV предназначен для обнаружения РНК энтеровируса (EV) (нетранслируемая 5’-область генома энтеровируса [UTR] между нуклеотидами 452 и 596) в образцах СМЖ. В тесте используются реагенты, праймеры и зонды для одновременного обнаружения нуклеиновой кислоты в целевом EV и контроля обработки образца/внутреннего контроля (SPC/IC). В тест включены SPC/IC для проверки адекватности обработки целевого вируса, кроме того в процессе теста проводится наблюдение за присутствием ингибиторов с целью исключения неверного отрицательного результата. В тест также включена функция проверки наличия зонда, которая служит для проверки регидратации реагента, целостности зонда и размещения пробирки для ПЦР в картридже.

Преимущества данного метода исследования:

  • высокочувствительный метод

  • процедура тестирования занимает 2,5 часа.

  1. Тест Xpert C. difficile - тест для определения Clostridium difficile в мазках. Быстрая диагностика энтеропатогенных штаммов Clostridium difficile и токсинов из образцов стула пациентов с диареей представляет собой качественный диагностический тест in-vitro для быстрой идентификации и дифференцировки токсина B и комбинированного токсина в соответствующих образцах стула, полученных у пациентов с подозрением на инфекцию Clostridium difficile (CDI). Тест использует автоматическую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени для определения токсин-продуцирующих штаммов C. difficile, которые связаны с CDI. Анализ Xpert C. difficile предназначен для помощи в постановке диагноза инфекции CDI. C. difficile представляет собой грамположительную образующую споры анаэробную палочковидную бактерию, которую впервые связали с заболеванием в 1978 году. CDI в проявлениях варьирует от диареи до тяжелого угрожающего жизни псевдомембранозного колита. Зрелая кишечная бактериальная флора у здоровых взрослых обычно устойчива к колонизации C. difficile . Тем не менее, если состояние нормальной кишечной микрофлоры изменено, резистентность к колонизации теряется. Наиболее частым фактором риска является воздействие антибиотиков. Первичными факторами вирулентности C. difficile являются энтеротоксин A и цитотоксин B. Гены, кодирующие токсин A (tcdA) и токсин B (tcdB), представляют собой часть локуса патогенности (PaLoc). Большинство патогенных штаммов токсин A-положительны и токсин B-положительны (A+B+), хотя токсин A-отрицательные, токсин B-положительные (A-B+) вариантные изоляты были идентифицированы как патогенные. Некоторые штаммы C. difficile также вырабатывают актин-специфичную АДФ-рибозилтрансферазу, называемую CDT или комбинированным токсином. Локус комбинированного токсина содержит два гена (cdtA и cdtB) и расположен за пределами PaLoc. В последние несколько лет фиксировались вспышки CDI, вызванный “гипервирулентными” и фторхинолон-устойчивыми штаммами, принадлежащими к риботипу ПЦР 027, PFGE типу NAP1 и REA типу B1. Эти штаммы демонстрируют увеличенное продуцирование токсина, что было отнесено на счет делеций в регуляторном гене tcdC. Диагноз C. difficile обычно основывается на выявлении токсина A или B. Трудоемкий клеточно-опосредованный анализ цитотоксичности до сих пор считается “золотым стандартом” из-за его высокой специфичности. Были разработаны несколько быстрых иммуноферментных тестов для выявления токсинов A и B. Однако эти тесты обладают сниженной чувствительностью и специфичностью по сравнению с клеточно-опосредованным анализом цитотоксичности. В последнее время были разработаны методы ПЦР для выявления токсина A и/или токсина B, имеющие более высокие чувствительность и специфичность по сравнению с клеточно-опосредованным анализом цитотоксичности и иммуноферментными тестами. Тем не менее коммерчески стандартизованные анализы ПЦР для выявления этих токсинов в настоящее время недоступны. Тест Xpert C. difficile включает реагенты для выявления продуцирующих токсины C. difficile и продуцирующих токсины C. difficile, предположительно типа 027/NAP1/BI соответственно, а также контроль обработки образца (sample processing control, SPC). Праймеры и пробы теста Xpert C. difficile выявляют последовательности генов токсина B (tcdB), комбинированного токсина (cdt) и делеции tcdC. Повреждение кишечной флоры антибиотиками является фактором риска для инфицирования C. Difficile. Энтеропатогенный C. difficile продуцирует два сильнодействующих токсина, которые вызывают развитие диареи и псевдомембранозного колита: токсин А, энтеротоксин, и токсин В, цитотоксин. Токсины продуцируются одновременно и действуют синергически. Недавно открытый бинарный токсин, который присутствует у примерно 6% штаммов C. difficile, является новым маркером вирулентности. Новый штамм NAP1/027 с делецией в гене репрессора продукции токсинов А и В (tcdC) вырабатывает в 16 раз больше токсина А и в 23 раза больше токсина В, а также продуцирует бинарный токсин. NAP1/027 также характеризуется повышенной резистентностью к антимикробным препаратам, что даёт ему возможность распространяться в лечебных учреждениях. Существующие диагностические тесты либо очень длительные (до 3-х дней), либо обладают малой чуствительностью – пропускают до 40% инфицированных пациентов. Повторение лабораторных анализов занимает много времени и повышает расходы. Многие пациенты долгое время не получают правильного диагноза и соответственно оптимальной терапии, что повышает риск распространения инфекции.

Преимущества данного метода исследования:

  • высокочувствительный метод

  • возможность диагностики высоковирулентного штамма C. difficile 027

  • процедура тестирования занимает 50 мин.

  1. Тест Xpert vanA/vanB – тест для определения ванкомицин-устойчивых энтерококков в мазках vanA/vanB. Это качественный диагностический тест in vitro , предназначенный для быстрого выявления генов ванкомицин-резистетности (vanA/vanB) в образцах ректальных и перианальных мазков у пациентов с риском колонизации кишечника ванкомицин-устойчивыми штаммами бактерий. Тест использует метод ПЦР в реальном времени для определения генов vanA и vanB, которые могут быть связаны с ванкомицин-устойчивыми штаммами энтерококков (VRE) и предназначен для помощи в распознавании, предотвращении и контроле колонизации ванкомицин-устойчивыми микробными штаммами в условиях учреждений здравоохранения. Ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE) стали главной причиной возникновения внутрибольничных инфекций, особенно в отделениях интенсивной терапии (ОИТ). Инфекционные заболевания, вызванные VRE, ведут к возрастанию заболеваемости, смертности, длительности госпитализаций и расходов медицинских учреждений. Риск колонизации VRE считается результатом применения многих классов противомикробных препаратов, включая гликопептиды, цефалоспорины третьего поколения и антибиотики с мощной анти-анаэробной активностью. Распространение VRE происходит путем контакта с колонизированными или инфицированными лицами в учреждениях здравоохранения. Таким образом, многие учреждения проводят программы активного обследования с целью выявления носителей VRE и их дальнейшей надлежащей изоляции для уменьшения передачи патогена. Тест Xpert vanA/vanB включает реагенты для выявления генов резистентности vanA и vanB, а также контроль обработки образца (sample processing control, SPC) для контроля адекватной обработки целевых бактерий и мониторинга наличия ингибитора(ов) в реакции ПЦР. Контроль проверки пробы (Probe Check Control, PCC) проверяет регидратацию реагентов, заполнение пробирки ПЦР в картридже, целостность пробы и стабильность красителя. Праймеры и пробы теста Xpert vanA/vanB определяют последовательности генов ванкомицин/тейкопланин-резистентности (vanA, vanB). Остановить и контролировать вспышку VRE инфекции трудно и дорого, текущая лабораторная диагностика является громоздкой и занимает до 5 дней. Быстрый высокочувствительный и специфический тест Xpert vanA/vanB может способствовать принятию надлежащих мер предосторожности и снижению темпов распространения VRE инфекции.

Преимущества данного метода исследования:

  • высокочувствительный метод

  • процедура тестирования занимает не более 45 мин.

  1. Тест Xpert MTB/RIF – тест на наличие Mycobacterium tuberculosis и ее устойчивости к рифампицину в образцах мокроты. Он предназначен для использования с системой GeneXpert Dx, и использует метод полуколичественной гнездовой ПЦР в реальном времени, проводимой in vitro с целью обнаружения: 1) ДНК Mycobacterium tuberculosis, являющейся кислотоустойчивой палочковидной бактерией, в образцах мокроты или концентрированных осадков мокроты, полученной после провокации или при кашле; 2) мутаций резистентности к рифампицину гена rpoB в образцах, полученных от пациентов с риском резистентности к данному препарату. Во всем мире насчитывает около 2 миллиардов человек, инфицированных M. tuberculosis1. Ежегодно приблизительно у 9 миллионов из них развиваются активные формы заболевания, а 2 миллиона — погибают от туберкулеза. Активный туберкулез преимущественно поражает легкие. Передача возбудителя при данной форме туберкулеза осуществляется с воздухом, что обусловливает высокую заразность заболевания. Инфекционная природа данной патологии обусловливает необходимость точной и быстрой диагностики состояния, что является важным компонентом адекватной терапии заболевания и контроля его распространения. Лечение туберкулеза заключается в длительном приеме многокомпонентной терапии, которая обычно обладает высоким эффектом. Однако штаммы M. tuberculosis (МБТ) могут быть резистентны к одному или нескольким лекарственным средствам комбинации, что снижает вероятность излечения. К лекарственным средствам терапии туберкулеза первой линии относятся изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид. По данным ВОЗ, резистентность к рифампицину встречается редко и обычно (у более 95 % подобных изолятов) свидетельствует о резистентности к ряду других противотуберкулезных средств — мультирезистентности штамма (MDR-TB). При этом мультирезистентность штамма определяется как одновременная резистентность штамма возбудителя, вызвавшего заболевание, по меньшей мере к изониазиду и рифампицину. Резистентность к рифампицину или другим препаратам первой линии терапии обычно свидетельствует о необходимости проведения полного тестирования на чувствительность, в том числе и к препаратам второй линии. Молекулярное определение возбудителя туберкулеза и мутации гена rpoB, ассоциирующейся с резистентностью к рифампицину, значительно ускоряет постановку диагноза как чувствительного к терапии, так и мультирезистеного туберкулеза. Тест Xpert MTB/RIF может проводиться со свежей мокротой и с приготовленным осадком; результаты могут быть получены менее чем за 2 часа. Быстрое определение MБT и резистентности к рифампицину позволяет врачу сделать важный выбор относительно необходимой терапии во время одного посещения пациента.

Преимущества данного метода исследования:

  • высокочувствительный метод

  • процедура тестирования занимает не более 2 часов.

  1. Тест Xpert BCR-ABL, обнаруживающий транслокацию хромосом BCR-ABL, облегчает контроль транскрипта p210 (b2a2 и b3a2) в лимфоцитах периферической крови (PBL) пациентов с хронической миелогенной лейкемией (CML).  

Хроническая миелогенная лейкемия (хронический миелолейкоз, Chronic myelogenous leukemia или CML) относится к группе заболеваний, называемых миелопролиферативными нарушениями. Рекомендации по лечению людей с CML включают в себя проведение анализа методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени при:

  • первичном обследовании пациентов с хронической стадией CML

  • контроле минимальных остаточных явлений заболевания

  • определении пациентов с повышенным риском рецидива.

Монитор Xpert BCR-ABL используется вместе с системой GeneXpert® Dx и предназначен для обнаружения транскрипта транслокации BCR-ABL и последовательности эндогенного контроля ABL в образцах периферической крови. Праймеры и зонд BCR-ABL были специально разработаны для обнаружения серьезных транслокаций областей разрывов гена BCR-ABL p210 (b2a2 и b3a2), а праймеры и зонды ABL — для детекции последовательности ABL. Праймеры и зонды ABL не перекрывают мутации киназы ABL, известные на сегодняшний день.

Для выполнения теста образец и три реагента переносятся в обозначенные отсеки картриджа монитора Xpert BCR-ABL, картридж устанавливается в прибор, а в системное программное обеспечение вводится информация о тесте. Во время процесса тестирования в системе GeneXpert® Dx (1) образец и реагенты перемещаются в различные камеры картриджа; (2) изолируется вся РНК из крови путем связывания РНК с твердофазным материалом; (3) проводятся 2 промывки ингибиторов; (4) элюируется РНК; (5) происходит гидратация гранул реагентов, и смесь объединяется с элюированной РНК; (6) смесь образца и реагента перемещается в реакционную пробирку; (7) выполняется проверка качества для того, чтобы подтвердить правильность подготовки образца; (8) проводится ПЦР в реальном времени. Процесс тестирования на BCR-ABL занимает примерно 2 часа 20 минут.



Преимущества данного метода исследования:

  • точный и высокочувствительный метод обнаружения гибридного гена

  • высокая степень корреляции результатов, полученных при исследовании образцов костного мозга и периферической крови

  • высокая скорость получения результатов (2 часа 20 мин)

Следовательно, данный метод позволит снизить количество пункций костного мозга, которое в настоящее время требуется от пациентов с хронической миелогенной лейкемией.

  1. Тест Xpert GBS для обнаружения ДНК стрептококка группы B (GBS) в образцах вагинальных/ ректальных мазков с использованием полностью автоматической ПЦР в реальном времени. Тест Xpert GBS предназначен для быстрой идентификации пренатальной и интранатальной инфекции GBS.

Бактериальная инфекция GBS вызывает серьезные заболевания новорожденных, родившихся у женщин, инфицированных данным микроорганизмом. Передача GBS от GBS-инфицированных женщин новорожденным осуществляется до родов (пренатальный период) или во время родов (интранатальный период). Инфекция GBS вызывает сепсис, пневмонию, менингит.

Тест Xpert GBS для интранатального скрининга не должен проводиться до использования других методик (например, пренатального тестирования). Интранатальное тестирование Xpert GBS полезно для определения кандидатов на профилактику антибиотиками во время родов, так как в этом случае результаты получаются быстро и можно без задержки начать внутривенное введение антибиотиков. Тест Xpert GBS не определяет чувствительность к антибиотикам.

В настоящее время стандартными методами предотвращения неонатального заболевания GBS является скрининг женщин на 35—37 неделе беременности на инфицированность GBS. Для большинства GBS-тестов, проводимых до родов, используется культура. Обычно результаты получаются в течение двух-трех дней. У большинства женщин, как правило, есть это время для ожидания результатов пренатального исследования на культуру GBS; однако некоторые женщины могут не иметь результатов теста в начале родов.

Тест Xpert GBS, разработанный компанией «Цефеид» для обнаружения GBS непосредственно в образцах вагинальных/ректальных мазков, занимает приблизительно 75 минут с момента начала исследования.



В тесте Xpert GBS используются реагенты для одновременного обнаружения целевой ДНК GBS, контроля обработки образца (SPC) для наблюдения за условиями обработки и внутреннего контроля (IC) для наблюдения за условиями ПЦР и отсутствием ингибирования реакции. Функция проверки наличия зонда служит для проверки регидратации реагента, размещения пробирки для ПЦР в картридже, целостности зонда и стабильности красителей. С помощью праймеров GBS и зонда, искомый участок гена цель обнаруживается в 3'-конце фрагмента ДНК, примыкающем к гену cfb S. agalactiae. После забора и передачи образца в область исследования GeneXpert в соответствующие отсеки картриджа Xpert GBS добавляются мазок и два реагента. В системе GeneXpert Dx осуществляется подготовка образца путем элюирования из мазка материала образца, смешивание реагента образца с SPC (Bacillus globigii в форме гранулы внутри картриджа) и реагента для обработки, захват клеточного материала на фильтре, лизис клеток и элюирование ДНК. Затем раствор ДНК смешивается с сухими реагентами ПЦР и передается во встроенную реакционную пробирку для проведения ПЦР в реальном времени и обнаружения инфекции. В системе GeneXpert Dx результаты интерполируются на основании измерения интенсивности флуоресцентных сигналов и встроенных вычислительных алгоритмов. Результаты можно вывести на экран и распечатать.

Преимущества данного метода исследования:

  • в результате интранатального тестирования сокращается использование ненужных антибиотиков женщинами

  • быстрый забор образцов и получение результатов в короткий срок (75 мин)

  • тест можно проводить 24 часа в сутки




  1. Тест Xpert Flu для определения вируса гриппа. Тестируемые последовательности (мультиплекс-ПЦР): Flu A Matrix, H1, H1N1 Новый, H3 и Flu B. Тест Xpert Flu учитывает сезонные изменения вируса гриппа. Внутренний контроль позволяет контролировать все этапы анализа, включая этап выделения РНК, обратной транскрипции и ПЦР. Клинические пробы: мазки из носоглотки и ротоглотки, смывы из носоглотки и ротоглотки, аспираты из носовой полости. Время проведения теста: Менее 1 часа. Чувствительность: > 95%. Специфичность: > 95%.

Преимущества данного метода исследования:

  • высокочувствительный метод

  • процедура тестирования занимает не более 1 часа.



- -

Каталог: files
files -> Вопросы сертификационного экзамена для врачей по специальности «лфк и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа составлена в соответствии с Требованиями к содержанию дополнительных профессиональных образовательных программ
files -> Рабочая программа дисциплины Лечебная физическая культура и массаж Направление подготовки 050100 Педагогическое образование
files -> Лечебная физкультура
files -> К рабочей программе дисциплины «Лечебная физкультура и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла Медицинская реабилитация для специальности 310501 «Лечебное дело» по специализации 310501 «Лечебное дело»
files -> Лекции (час) Семинары (час) Самост работа Всего баллов Модуль 1
files -> Влияние мобильного телефона на здоровье человека


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница