Безопасность и иммуногенность тривалентной инактивированной гриппозной вакцины с новым адъювантом



Pdf просмотр
страница3/6
Дата28.09.2017
Размер3.69 Mb.
1   2   3   4   5   6
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ «ИЭМ»).
2.1. Объекты исследования
В ходе проведения доклинических исследований были использованы следующие материалы, представленные в таблице 1.
Таблица 1 -Материалы, используемые в доклинических исследованиях

Наименование материала исследования
Количество
Исследован
ие
1.
Препараты на доклинические исследования
1.1.
Вирионы вируса гриппа типов А, Аи В Субъединицы вируса гриппа типа А(H1N1),
типа Аи типа В (HA A(H1N1) и A(H3N2) по 5,0 ± 1,0 мкг HA В - 11,0 ± 2,0 мкг);
Адъюванты: Полиоксидоний
®
(500 мкг);
Гидроксид алюминия (500 мкг Совидон (500 и мкг Субъединицы вируса гриппа типов Аи В
с каждым адъювантом
В объеме 0,5 мл
Электронно- микроскопическое изучение
1.2.
Вакцина Совигрипп без мертиолята (Совидон
500 мкг и 250 мкг Вакцина Совигрипп с мертиолятом (Совидон 500 мкг и 250 мкг);
Вакцина Гриппол; Физиологический раствор;
Совидон 250 мкг и 500 мкг A(H1N1) и) – по ± 1,0 мкг В - 11,0 ±
2,0 мкг в объеме 0,5 мл
Изучение безопасности и
иммуногенно сти
2.
Лабораторные животные (N = 86 особей)
2.1.
Кролики породы Шиншилла (m = 2-2,5 кг особей
Изучение пирогенности
Продолжение таблицы 1 Хорьки (m = 1,1-1,5 кг особей
Изучение безопасности и иммуногенности
2.3.
Беспородные мыши (m = 10-12 г особи
Изучение безопасности и антигенной активности
3.
Биоматериалы лабораторных животных
3.1.1.
Кровь хорьков проб
Изучение безопасности и иммуногенности
3.1.2.
Кровь мышей пробы
Изучение антигенной активности
3.1.3.
При патоморфологическом исследовании изучали легкие, сердце, селезенку, печень,
головной мозг, слизистую тонкого кишечника от
80
особей
Изучение безопасности и иммуногенности
В ходе проведения клинического исследования (КИ) были использованы следующие материалы, представленные в таблице 2.
Таблица 2 - Материалы, используемые в клиническом исследовании
№ п/п
Наименование материала исследованияКоличество
Исследование
1.
Препараты (N = 330 доз)
1.1.
Вакцина Совигрипп с консервантом доз этап КИ
80 доз этап КИ
1.2.
Вакцина Совигрипп без консерванта доз этап КИ
80 доз этап КИ
1.3.
Вакцина Гриппол
80 доз этап КИ
Продолжение таблицы 2 Физиологический раствор для инъекций 0,9 %
30 доз
Плацебо (I этап КИ)
2.
Объекты наблюдения (N = 330 человек в возрасте 18-60 лет (серонегативные по
A(H1N1), A(H3N2) и В))
2.1.
Мужчины
40 человек этап КИ
86 человек этап КИ
Женщины
50 человек этап КИ
154 человека этап КИ
3.
Биоматериалы добровольцев
3.1.
Кровь добровольцев (N = 1320 проб)
3.1.1.
Мужчины
160 проб
Гематологический,
биохимический,
серологический анализы и определение общего на I этапе КИ
344 проб
Тоже на II этапе КИ
3.1.2.
Женщины
200 проб
Гематологический,
биохимический,
серологический анализы и определение общего на I этапе КИ
616 проб
Тоже на II этапе КИ
Продолжение таблицы 2 Моча добровольцев (N = 990 проб)
3.2.1.
Мужчины
120 проб
Проведение общего анализа мочи на I этапе
КИ
258 проб
Проведение общего анализа мочи на II этапе
КИ
3.2.2.
Женщины
150 проб
Проведение общего анализа мочи на I этапе
КИ
462 проб
Проведение общего анализа мочи на II этапе
КИ
4.
Документация по каждому добровольцу
4.1.
ИРК, Дневники самонаблюдения добровольцев (по N = 330 шт.)
4.1.1.
Мужчины по 40 шт этап КИ
по 86 шт этап КИ
4.1.2.
Женщины по 50 шт этап КИ
по 154 шт этап КИ
4.2.
Амбулаторные карты (N = 330 шт.)
4.2.1.
Мужчины
40 шт этап КИ
86 шт этап КИ
4.2.2.
Женщины
50 шт этап КИ
154 шт этап КИ

47
Вакцинные штаммы
Для изготовления экспериментальных серий гриппозной вакцины использовали следующие вакцинные штаммы, полученные из NIBSC (National
Institute for Biological Standard Control Serum, Англия. В доклинических исследованиях:

A/Брисбен/59/07 IVR-148 А X-175C (H3N2), подобный А/Уругвай/716/2007 и
A/Брисбен/10/07 А, подобный B/Брисбен/60/08.
В клинических исследованиях:

А/Калифорния/07/09 А(H1N1)pdm09;

A/Висконсин/15/09 А(H3N2);

В/Брисбен/33/08.
Адъюванты
В качестве адъювантов инактивированной сезонной гриппозной вакцины использовали алюминия гидроксид
(«Brenntag
Biosector»,
Дания),
Полиоксидоний
®
(«Группа Компаний Петровакс», г. Москва) – Mr = 60 000 –
100 000 Да, сополимер 2-метил-5-винилпиридина и N – винилпирролидона
(Совидон) (ЗАО Институт фармацевтических технологий, г. Москва) - Mr =
46 000 – 60 000 Да.
Исследуемые препараты
На основе вакцинных штаммов было разработано несколько экспериментальных серий вакцин, в том числе и бесконсервантных,
содержащих различные адъюванты.
В одной прививочной дозе (0,5 мл) во всех экспериментальных сериях содержалось гемагглютинин вируса гриппа подтипов A(H1N1) и A(H3N2) – по ± 1,0 мкг гемагглютинин вируса гриппа типа В – 11,0 ± 2,0 мкг, а также 85 -

48 115 мкг/мл мертиолята (за исключением серии без консерванта. Содержание адъювантов в экспериментальных сериях вакцин алюминия гидроксид –
500 мкг Совидон – 500 или 250 мкг.
В качестве препарата сравнения была выбрана полимер-субъединичная тривалентная вакцина Гриппол, применяемая в России для массовой иммунизации населения против сезонного гриппа. На 1 прививочную дозу мл) вакцины Гриппол приходится гемагглютинин вируса гриппа подтипов) и A(H3N2) – по 5,0 ± 1,0 мкг гемагглютинин вируса гриппа типа В -
11,0 ± мкг Полиоксидоний - 500 мкг консервант – мертиолят (85-
115 мкг/мл).
В качестве плацебо использовали физиологический раствор для инъекций 0,9 Все препараты производились на филиале ФГУП НПО «Микроген»
Минздравсоцразвития России в г. Уфа «Иммунопрепарат».
2.2. Методы исследования
2.2.1. Биохимические методы
2.2.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле
Чистоту и спектр антигенов, входящих в состав экспериментальных гриппозных вакцин,
определяли методом электрофореза в
12 %
полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДДС) в соответствии с методикой, в невосстановленных и
восстановленных условиях (толщина геля 0,75 мм) с последующей окраской геля Кумасси ярко-голубым R-250. Восстановленные условия отличались тем,
что дополнительно использовали восстанавливающий агент- меркаптоэтанол. В испытаниях использовали полуфабрикаты вакцин без стабилизаторов, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы. Образцы в концентрации 1 мг/мл разводили равным
объемом буфера для нанесения и кипятили при 95
о
С в течение 5 мин на водяной бане. В штрек вносили 20 мкл образца (10 мкг белка. Для полного выхода белка электрофорез проводили в денатурирующих условиях – в присутствии детергента и при кипячении пробы. Все буферы содержат 0,1 %
ДДС. Условия электрофореза (12% ДДС-ПААГ) представлены в таблице состав буфера для нанесения – в таблице 4, а для десятикратного электродного буфера – в таблице 5.
Таблица 3 -Условия электрофореза (12% ДДС-ПААГ)
Разделяющий гель
(объем)
Концентрирующий гель
(объем)
Акриламид
6 мл мл
Дистиллированная вода мл мл М Трис-НСl (pH 8,8)
3 мл M Трис-НСl (pH 6,8)
0,5 мл
ДДС 10%
150 мкл мкл
Тетраэтилметилендиамин
7,5 мкл мкл
Персульфат аммония 10%
50 мкл мкл
Таблица 4 -Буфер для нанесения
Объем/количество (в мл или мг, г М Трис-НСl (pH 6,8)
2,5 мл
ДДС
1 г
Глицерин 87 %
5,8 мл
Бромфеноловый синий мг
β-меркаптоэтанол (для восстанавливающего электрофореза мл
Дистиллированная вода мл (довести общий объем до 50 мл водой)

50
Таблица 5 -10х Электродный буфер
Количество (в мл или мг, г)
Трис
30,3 г
Глицин
144,2 г
ДДС
10 г довести дол, рН должен быть 8,3
2.2.2. Вирусологические методы
2.2.2.1. Электронная микроскопия методом негативного контрастирования
Все материалы, содержавшие биологические структуры (вирионы или субъединицы вируса)
перед проведением электронной микроскопии подвергались диализу для удаления содержавшейся в них сахарозы с целью улучшения контраста и получения качественного изображения. Электронную микроскопию выполняли методом негативного контрастирования по стандартной методике (Шиммель, Процедуру диализа проводили в течение 18 ч при температуре 4
о
С против М фосфатно-солевого буферного раствора (рН – 7,2).
Диализованный материал адсорбировали на медных сеточках, покрытых формваровой пленкой, стабилизированной углеродом, дополнительно промывали физиологическим раствором, содержавшим 0,5 % Twin 20, для удаления следов сахарозы и контрастировали 1 % фосфорновольфрамовой кислотой (рН Препараты, содержавшие только адъюванты, промывали физиологическим раствором без Twin 20 и контрастировали фосфорновольфрамовой кислотой
(рН – Препараты исследовали в электронном микроскопе JEM 100-СХ (JEOL,
Япония)
методом негативного контрастирования при инструментальном увеличении 5800 – 58 000 х, напряжении 80 кВ и апертурной диафрагме 50 мкм.
Фотографирование производили на специализированную фотопленку (Германия).
2.2.3. Методы работы с лабораторными животными
2.2.3.1. Оценка безопасности и иммуногенности экспериментальных
гриппозных вакцин на мышах
Животные.
Работа с животными проводилась в соответствии с
«Правилами лабораторной практики (Минздрава РФ, 2003). Для изучения антигенной активности использовали беспородных белых мышей (m = 10 - г. Лабораторные животные были получены из питомника лабораторных животных
ГУП
"Иммунопрепарат"
Чишминского района республики
Башкортостан.
Схема оценки безопасности и антигенной активности гриппозных
вакцин in vivo. Мышам вакцины вводили внутримышечно двукратно по 0,5 мл с интервалом 7 суток. Мыши (n = 132) были распределены в 4 группы:
1 группа – вводили вакцину Совигрипп (Совидон 500 мкг) (n = 36);
2 группа – вводили вакцину Совигрипп (Совидон 250 мкг) (n = 36);
3 группа – вводили безадъювантную инактивированную гриппозную вакцину (n = 36);
4 группа – вводили однократно 0,5 мл физиологического раствора (n Безопасность оценивали по прибавке массы тела, а также по поведению животных и их внешнему виду по сравнению с группой контроля. Взвешивание животных осуществлялось на электронных весах «V–600» высокого класса точности (ЗАО "Фартогосм", г. Санкт-Петербург) до введения препарата, на 7 и сутки. Через 14 дней после повторной иммунизации мышей эвтанизировали передозировкой эфира и проводили тотальный забор крови из сонных артерий.
Сыворотки мышей исследовались в реакции торможения гемагглютинации
(РТГА) с гомологичными антигенами вакцины. Для постановки РТГА
использовали эритроциты кур. Парные сыворотки от каждого животного исследовали водном опыте.
Титр антител определялся в РТГА по
МУ 3.3.2.1758-03.
2.2.3.2. Оценка безопасности и иммуногенности экспериментальных
гриппозных вакцин на хорьках
Животные.
Работа с беспородными хорьками =
1,1-1,5 кг)
проводилась в соответствии с Правилами лабораторной практики (Минздрава
РФ, 2003) на базе вивария филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России – ВЦ».
Схема оценки безопасности и иммуногенности гриппозных вакцин in
vivo. Хорьки, серонегативные к вакцинным штаммам, были распределены в групп (n = 80):

1 группа – хорькам (n = 20) вводили вакцину Совигрипп (Совидон
500 мкг группа - хорькам (n = 20) вводили вакцину Совигрипп (Совидон
250 мкг группа - хорькам (n = 10) вводили препарат Совидон 500 мкг группа - хорькам (n = 10) вводили препарат Совидон 250 мкг группа - хорькам (n = 10) вводили препарат сравнения – вакцину
Гриппол;

6 группа - хорькам (n = 10) вводили физиологический раствор.
Сыворотки крови лабораторных животных забирали для оценки уровня антител к гемагглютининам вирусов гриппа типа Аи В до иммунизации, на и 21 сутки после иммунизации. Перед проведением РТГА сыворотки обрабатывались рецептор-разрушающим энзимом - Receptor Destroying Enzyme
(RDE). Постановку РТГА осуществляли по МУ 3.3.2.1758-03., используя куриные эритроциты, а также диагностикум гриппозный типа А (H1N1) для
РТГА, штамм А/Брисбен/59/07 и диагностикум гриппозный типа В для РТГА,
штамм В/Астрахань/01/07 (ООО «ППДП», Россия) и маточный материал вируса гриппа А, штамм A/NYMC Х (На 21 сутки исследования животных подвергали эвтаназии путем внутримышечного введения раствора препарата «Золетил 100» в дозе 120 мг/кг в 0,12 мл до полного угнетения основных функций центральной нервной системы и проводили некропсию и гистологические исследования.
Гистологические исследования. Исследования проводились в филиале
Федерального государственного учреждения «48 Центральный научно- исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации -Вирусологический центр. Из исследуемых органов вырезали образцы см) и нач погружали их в фиксирующий раствор (10 % раствор формальдегида. После фиксации образцы промывали проточной водой в течение нескольких часов. Для обезвоживания образцов использовали следующую последовательность спиртов – 70 %, 80 %, 96 % этанола. В 70 % и % этаноле спирты выдерживались почв ч. Затем образцы уплотняли – чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. В
качестве уплотнителя использовался парафин. Из парафиновых блоков делали срезы толщиной 4-5 мкм. Срезы окрашивали стандартными методами:
гематоксилин-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону (Волкова и Елецкий, и исследовали световой микроскопией. Гистологические исследования проводили у всех животных, которые были подвергнуты эвтаназии путем внутримышечного введения раствора препарата «Золетил 100».
2.2.3.3. Оценка пирогенности гриппозных вакцин на кроликах
Животные.
Работа с животными проводилась в соответствии с
«Правилами лабораторной практики (Минздрава РФ, 2003). Для оценки пирогенности использовали кроликов (n = 6, m = 2-2,5 кг. Лабораторные
животные были получены из питомника лабораторных животных ГУП
"Иммунопрепарат" Чишминского района республики Башкортостан.
Схема оценки пирогенности гриппозных вакцин in vivo. Исследование проводили согласно методике описанной в XII Государственной фармакопеи
РФ (часть I). Препарат признают пирогенным если сумма максимальных повышений температуру трех кроликов ∑Δt больше 1,2 С, а индивидуальное повышение температуры - 0,5 ºС.
Перед опытом, с интервалом не менее 30 мину каждого кролика дважды измеряли температуру тела. Если различия в показаниях температуры у одного итого же животного превысило 0,2 Сего исключают из исследования. За исходную температуру принимали величину последнего результата измерения.
Одну дозу (0,5 мл) испытуемых вакцин вводили в ушную вену кроликов.
Ректальную температуру у кроликов измеряли дои после инъекции с точностью до 0,1 С. Термометр вводили впрямую кишку кролика на глубину см. Зач до испытания кроликов лишали корма без ограничения воды.
Температуру после введения вакцин измеряли с интервалом не более 30 мин на протяжении трех часов.
2.2.4. Иммунологические методы для оценки показателя иммунного ответа
2.2.4.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Обработка сывороток. Перед постановкой реакций гемагглютинации,
микронейтрализации для удаления неспецифических ингибиторов вируса гриппа сыворотки обрабатывали препаратом RDE (receptor–destroying enzyme производства Denka–Seiken, Tokyo, Japan) согласно протоколу производителя.
Постановка РТГА. Реакцию РТГА проводили в соответствии с методическими указаниями по определению показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа по
МУ 3.3.2.1758-03. Парные сыворотки от каждого животного исследовали в
одном опыте. Готовили серию двукратных разведений сывороток на ФР (от до 1:1280) в объеме 50 мкл. Для этого в лунок каждого ряда вносили по мкл ФР. В первую лунку вносили 50 мкл исследуемой сыворотки,
разведенной враз и прогретой при 56 Си после х кратного перемешивания, переносили 50 мкл разведенной сыворотки в следующую лунку, процедуру повторяли, титруя сыворотку, из последней (ой) лунки избыток (50 мкл) разведенной до 1:1280 сыворотки, сбрасывали. К каждому разведению сыворотки добавляли по 50 мкл (4 ГАЕ) стандартизованного гриппозного антигена. Панели встряхивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку, включая контрольные
(по 100 мкл ФР, добавляли по 100 мкл 0,5 % куриных эритроцитов.
Учет результатов. Результаты реакции учитывали после оседания эритроцитов в контрольных лунках планшета (через 30-40 мин. Титром вирусспецифических антител в сыворотке считали ее наибольшее разведение,
при котором наблюдается полная ингибиция агглютинации эритроцитов в результате взаимодействия вируса со специфическими антителами.
2.2.5. Клинические исследования
В рамках данной работы по конструированию и изучению безопасности и эффективности новой адъювантной гриппозной вакцины были проведен широкий спектр исследований, в том числе клинические исследования.
Клиническое исследование гриппозной вакцины
Совигрипп

Совидоном) проводились в 2010-2011 гг. в соответствии с Федеральным законом Российской Федерации от 12 апреля 2010 г. N 61-ФЗ "Об обращении лекарственных средств, приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г.
«Правила клинической практики в Российской Федерации, национальным стандартом Российской
Федерации
ГОСТ Р Надлежащая клиническая практика, согласно Европейским предписаниям пои
56
Хельсинской Декларации и протоколу, одобренному Комитетом по Этике и
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. На проведение клинического исследования от Министерства здравоохранения и социального развития
Российской Федерации было получено разрешение № 28 от 10 декабря 2010 г.
Клиническое исследование вакцины Совигрипп проводилось на базах аккредитованных Росздравнадзором клинических центрах. ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России, Отделение апробации новых клинических технологий и препаратов (г. Санкт-Петербург);
2. ГОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера (г. Пермь).
Оценка переносимости, реактогенности, безопасности и иммуногенности проводилась в рамках простого слепого рандомизированного многоцентрового исследования. Клиническое исследование было проведено в два этапа. На первом этапе изучали переносимость, реактогенность и безопасность вакцины
Совигрипп на ограниченном контингенте добровольцев в возрасте от 18 до лет (90 добровольцев, которые были рандомизированы в три группы одна контрольная (плацебо, две другие получали исследуемые вакцины (с консервантом и бесконсервантную форму. На втором этапе исследовали переносимость, реактогенность,
безопасность и иммуногенность
- на расширенном контингенте добровольцев в возрасте
18

60 лет добровольцев, которые были рандомизированны в три группы две получали исследуемую вакцину
Совигрипп с консервантом и
бесконсервантную форму, группа сравнения получала коммерческую вакцину
Гриппол. В исследование приняли участие добровольцы, у которых величина титра специфических антител ко всем трем вакцинным штаммам был не выше
1:20.
Реактогенность и безопасность гриппозных вакцин оценивали по витальным показателям артериальное давление,
частота сердечных сокращений, температура тела, результатам неврологического осмотра,
данным лабораторных анализов (общий анализ мочи, общий и биохимический анализ крови, Е) и нежелательным явлениям (местные и системные реакции).
Оценку местных и системных реакций проводили согласно МУ
3.3.2.1758-03 Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа».
К
системным реакциям относили повышение температуры тела,
недомогание и др. К местным реакциям – болезненность, гиперемия и развитие инфильтратов вместе инъекции.
Наличие температуры до 37,5º С включительно расценивали как слабую реакцию, от 37,6º до С включительно – как среднюю, от 38,6º Си выше как сильную.
Покраснение без инфильтрата диаметром до 50 мм на месте прививки или инфильтрат диаметром до 25 мм расценивали как слабую местную реакцию,
красноту диаметром более 50 мм или инфильтрат диаметром 26 – 50 мм – как среднюю, инфильтрат более 50 мм в диаметре – как сильную местную реакцию.
Безопасность также оценивали лабораторно-инструментальными методами по показателям общего анализа крови (гемоглобин, эритроциты,
лейкоциты, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты,
тромбоциты, СОЭ), общего анализа мочи (удельный вес, р, белок, билирубин,
глюкоза, эритроциты, лейкоциты) и биохимического анализа крови (С- реактивный белок, мочевина, АЛТ, АСТ, общий белок, щелочная фосфотаза), а также определения уровня суммарного IgE в сыворотке крови. Забор материала для исследования проводили до вакцинации, на 7 и 21 дни исследования.
Иммуногенность инактивированных вакцин оценивали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по фактору сероконверсии, величине среднегеометрического титра (СГТ), уровням сероконверсии и серопротекции в сыворотках крови привитых в соответствии с критериями СРМР ЕМЕА
(2001 г) и МУ 3.3.2.1758-03 (табл. 6, 7) до вакцинации и надень после вакцинации.

58
Таблица 6 - Критерии иммуногенности гриппозных вакцин (возрастная группа лет) (СРМР ЕМЕА, СРМР/ЕWР/1045/01)
Критерии иммуногенности
Значения
Фактор сероконверсии (повышение средних геометрических титров антител надень по сравнению с исходным уровнем, выражен в кратности увеличения
Более Уровень сероконверсии (отношение количества добровольцев, у которых титр антител повысился более чем в 4 раза по сравнению с исходным уровнем, и, у которых надень титр не менее Более 40 Уровень серопротекции (процент лицу которых титр антител более надень после вакцинации)
Более 70 %
Таблица 7 - Критерии иммуногенности гриппозных вакцин для взрослых,
утвержденные Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (МУ 3.3.2.1758-03)
Критерии иммуногенности
(взрослые от 18 до 55 лет)
Вакцинный штамм
вируса гриппа
Тип А
Тип В
Величина титра антител до вакцинации
≤ 1:20
≤ 1:20
Вакцина должна вызывать прирост гомологичных антител в крови в 4 и более раз после однократного введения вакцины % и более % и более
Определение концентрации IgE в сыворотках крови добровольцев
Концентрацию IgE оценивали в иммуноферментном анализе с использованием набора «IgE общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест ЗАО, Россия),
предназначенного для определения концентрации общего IgE в сыворотки крови. Чувствительность – 2,5 МЕ/мл. Диапазон измерений 0 - 750 МЕ/мл.
Постановка РТГА
Реакцию РТГА проводили в соответствии с методическими указаниями по определению показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа по МУ 3.3.2.1758-03. Сыворотки крови
предварительно обрабатывались рецептор-разрушающим энзимом - Receptor
Destroying Enzyme (RDE), производства японской фирмы Denka Seiken Co. К мл сыворотки добавляли 0,3 мл восстановленного в физиологическом растворе RDE. Смесь инкубировали при 37 Св течение ночи (18 - 20 ч) при перемешивании. Обработанную сыворотку прогревали на водяной бане при Св течение 30 – 60 мин. Чтобы получить разведение 1:10 к прогретой сыворотке добавляли 0,6 мл физиологического раствора. Сыворотки,
полученные входе скрининга и надень, после вакцинации, исследовали водном опыте. Готовили серию двукратных разведений сывороток (от 1:10 до) в объеме 50 мкл. Для этого в 8 лунок каждого ряда вносили по 50 мкл физиологического раствора. В первую лунку вносили 50 мкл исследуемой сыворотки, разведенной враз и прогретой при 56 Си после х кратного перемешивания переносили 50 мкл разведенной сыворотки в следующую лунку, процедуру повторяли, титруя сыворотку. Из последней (ой) лунки избыток (50 мкл) разведенной до 1:1280 сыворотки сбрасывали. К каждому разведению сыворотки добавляли по 50 мкл (4 ГАЕ) стандартизованного гриппозного антигена. Панели встряхивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку, включая контрольные,
добавляли по 100 мкл 0,5 % куриных эритроцитов. Результаты реакции учитывали после оседания эритроцитов в контрольных лунках планшета (через – 40 мин).
Все операции по взятию и обработке потенциально инфекционных клинических материалов проводили в одноразовых перчатках и масках, после использования материалы и контактировавшая сними лабораторная посуда подлежала обработке 6 % раствором перекиси водорода в течение 4 ч.
Титром вирусспецифических антител в сыворотке считали ее наибольшее разведение, при котором наблюдается полное ингибирование агглютинации эритроцитов в результате взаимодействия вируса со специфическими антителами.

60
2.3. Статистическая обработка данных
Для создания базы данных была использована программа MS Статистическая обработка данных проводилась с использование параметрических и непараметрических критериев на персональном компьютере с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 компании StatSoft. Выбор методов статистической обработки был обусловлен характером распределения изучаемых признаков (проверка по критерию Шапиро-Уилка) и типом данных.
Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики среднее арифметическое, стандартное отклонение,
среднегеометрические титры. Оценка статистической значимости различий проводилась с применением параметрических критерий
Стьюдента,
дисперсионный анализ) и непараметрических (критерий Манна-Уитни,
критерий Краскела-Уоллиса) критериев. Во всех процедурах статистического анализа нулевые гипотезы (Н) не отвергались на уровне значимости α ˃ 0,05 и отвергались на уровне значимости α ˂ 0,05. За исключением случаев попарного сравнения, где для преодоления проблемы множественных сравнений была применена поправка Бонферрони, понижающая уровень значимости. В этом случае нулевые гипотезы (Н) не отвергались на уровне значимости α ˃ и отвергались на уровне значимости α ˂ 0,05/κ (1), где κ – количество сравнений, вычисляемые по формуле κ = (n(n-1))/2 (2), где n - количество групп доверительный интервал для пропорций в процентах при 5% уровне значимости (α ≤ 0,05) рассчитывали по формуле:
,
(3)
где р - процент индивидуумов в выборке с интересующими нас свойствами;
n – размер выборки.
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница