Безопасность и иммуногенность тривалентной инактивированной гриппозной вакцины с новым адъювантом


ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ



Pdf просмотр
страница4/6
Дата28.09.2017
Размер3.69 Mb.
1   2   3   4   5   6
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Анализ полипептидного состава концентратов экспериментальных
гриппозных вакцин
Для определения чистоты и спектра антигенов, входящих в состав экспериментальной гриппозной вакцины, применяли метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в невосстановленных и восстановленных условиях (Laemmli, 1970). Для создания восстановленных условий использовали – β-меркаптоэтанол, который восстанавливает S-S связи,
что приводит к разделению полимеров (агрегатов, тетрамеров, димеров) на мономеры. Таким образом, например из гемагглютинина вируса гриппа можно выделить две субъединицы и Данные по полипептидному составу концентратов субъединиц вируса гриппа различных субтипов представлены на рисунках 5 - 7.
Рисунок 5 - Полипептидный состав концентрата субъединиц вируса гриппа подтипа
А(H1N1), где H1N1 – концентрат вируса гриппа А КЦ1 – концентрат субъединиц вируса гриппа А(H1N1)

62
Рисунок 6 - Полипептидный состав концентрата субъединиц вируса гриппа подтипа
А(H3N2), где H3N2 – концентрат вируса гриппа А КЦ2 – концентрат субъединиц вируса гриппа А(H3N2)
Рисунок 7 - Полипептидный состав концентрата субъединиц вируса гриппа типа В, где В концентрат вируса гриппа В КЦ3 – концентрат субъединиц вируса гриппа В
Как видно из рисунков молекулярная масса полипептидов вирусов гриппа в составе экспериментальных субъединичных вакцин (концентраты субъединиц

63
– КЦ1, КЦ2 и КЦ3): тримеров, димеров и мономеров гемагглютинина и нейраминидазы, а также М-белка не отличалась от молекулярной массы полипептидов, входящих в состав цельных вирионов вируса гриппа (А(H1N1);
А(H3N2) и В. Анализ антигенного спектра концентратов субъединиц вируса гриппа свидетельствует об отсутствии в составе экспериментальных субъединичных вакцин нуклеопротеина (внутреннего белка) вируса гриппа и неспецифических белков субстрата (рисунки 5 - 7 Невосстановленные условия),
а также существенное снижение содержания М-белка по сравнению с концентратами цельных вирионов вируса гриппа.
Полученные концентраты гриппозных вакцин содержали преимущественно субъединицы гемагглютинина и нейраминидазы: 95,5 % в концентрате вируса гриппа А 96,5 % - для подтипа А 98,6 % - для гриппа типа В. Поданным денситометрии матриксный белок (М-белок)
был представлен в следовых количествах около 3,5 % в концентрате вируса гриппа А 1,4 % - гриппа В и около 4,5 % - гриппа А(H1N1).
Молекулярная масса полипептидов вируса гриппа в образцах разных подтипов вируса гриппа варьировала в следующих пределах М-белок - 26 –
28 кДа; мономер HA – 75 -80 кДа; Г- 49 – 58 кДа; Г- 25 – 30 кДа; NA - 55
– 65 кДа; димер NA - 110 – 130 кДа; димер Г - 150 – 160 кДа; тример Г - 225
– 240 кДа, которые соответствуют данным литературы (Gregoriades, 1972;
Haslam et al., 1970; Klenk et al., 1972; Lazarowitz et al., 1971; Lazarowitz et al.,
1973; Lazdins et al., 1972; Skehel & Schild, 1971; Stanley et al., Полученные данные позволяют утверждать, что исследуемые образцы содержали необходимые антигены для создания инактивированной субъединичной вакцины против сезонного гриппа в достаточно высокой концентрации. Посторонних белков и белков субстрата накопления вируса гриппа в исследуемых вакцинах отмечено не было, что свидетельствует о высокой степени очистки препарата от балластных включений.

64
3.2. Морфологические характеристики экспериментальной гриппозной
вакцины при добавлении адъюванта Совидон
Способность адъюванта к взаимодействию с антигенами является ключевым фактором, обеспечивающим усиление иммунного ответа на компоненты вакцины. В связи с этим, представлялось интересным провести электронно-микроскопическое исследование экспериментальных вакцинных препаратов. Кроме экспериментальных вакцин с помощью электронной микроскопии были отдельно исследованы образцы вирионов вируса гриппа и их субъединиц.
Концентрат вирионов вируса гриппа типов Аи В представляли собой очищенную и концентрированную взвесь. Вирионы имели шаровидную,
удлиненную или неправильную форму с диаметром около 100 нм. Наблюдалось небольшое количество нитевидных частиц, что характерно для свежеприготовленного вирусного препарата. На поверхности вирионов выявлялись многочисленные интактные параллельно ориентированные молекулы гемагглютинина (риса, б).
А Б
Рисунок 8 - Электронная микрофотография концентрата вирионов вируса гриппа Аи В:
А – нитевидные частицы вируса гриппа Б – вирионы гриппа классической формы.
Увеличение 100 000 х. Масштабная линейка соответствует 100 нм (предоставлено в.н.с.
НИИВС им. Мечникова РАМН Лотте В.Д.)
В концентрате субъединиц были обнаружены как свободный гемагглютинин, таки розетки гемагглютинина (на рисунке указаны стрелками)
(рис. 9). Выявлялось небольшое количество мембран вириона в виде одиночных линейных структур (на рисунке указана стрелкой со звездочкой. На поверхности мембран, в подавляющем большинстве случаев, присутствовали правильно ориентированные интактные молекулы гемагглютинина (рис. 9).
Рисунок 9 - Электронная микрофотография субъединичных структур вируса гриппа.
Стрелками обозначены скопления гемагглютинина, стрелка со звездочкой указывает на фрагмент вирионной мембраны. Увеличение 200 000 х. Масштабная линейка соответствует нм (предоставлено в.н.с. НИИВС им. Мечникова РАМН Лотте В.Д.)
В экспериментальной вакцине с Совидоном адъювант представлял собой каплевидные образования, состоявшие из аморфного материала с включенными в него электронно-плотными наночастицами (рисунок 10 А, которые имели размер 80 – 350 нм. Морфологически они были сходны со структурами,
образуемыми полиэлектролитами.
Важно отметить факт взаимодействия антигенных структур вакцины с адъювантом.
До добавления вирусных субъединиц препарат
Совидон представлял собой бесструктурную электронно-плотную массу (рис. 10 Гав составе вакцины - комплекс наночастиц размером 80 - 350 нм (рис. 10 А. На рисунках 10 А, Б и В представлены наноцастицы, образованные адъювантом и

66
субъединичными компонентами вакцины. Видно, что они имеют заметное сходство с виросомами.
Рисунок 10 - Электронная микрофотография взаимодействие вирусных субъединиц с препаратом Совидон в составе экспериментальной вакцины (А, Б, В Препарат Совидон (Г).
Увеличение Ах Б, В - 210 000 х Г – 190 000 х. Масштабная линейка соответствует нм (предоставлено в.н.с. НИИВС им. Мечникова РАМН Лотте В.Д.)
В гриппозной вакцине с гидроксидом алюминия не обнаружено взаимодействия адъюванта с субъединичными структурами вируса гриппа. В
изученных образцах адъювант был представлен неструктурированным бесформенным электронно-плотным образованием (рис. 11).
Рисунок 11 - Электронная микрофотография гидроксида алюминия Увеличение 200 000 х.
Масштабная линейка соответствует 100 нм (предоставлено в.н.с. НИИВС им. Мечникова
РАМН Лотте В.Д.)

67
Полиоксидоний в составе экспериментальной вакцины взаимодействовал с вирусными субъединицами с образованием наночастиц размером 70-500 нм неправильной формы (рис. 12 А. В образцах также выявлялись конденсаты материала, морфологически идентичного материалу гранул. Указанные конденсаты, вероятно, представляют собой матрикс, из которого формировались гранулы адъюванта.
Биологический материал (рисунок 12 Б) имел структуру, типичную для субвирионных образований, и состоял из смеси фрагментов вирионных мембран и гемагглютинина.
Рисунок 12 - Электронная микрофотография взаимодействие вирусных субъединиц с препаратом Полиоксидоний в составе экспериментальной вакцины. Увеличение Ах Б - 200 000 х. Масштабная линейка соответствует 100 нм (предоставлено в.н.с.
НИИВС им. Мечникова РАМН Лотте В.Д.)
Таким образом, оба полиэлектролита формируют наночастицы с гемагглютинином вируса гриппа. Преимуществом Совидона по сравнению с
Полиоксидонием является его способность к образованию наночастиц размером 80–350 нм, сходных с виросомами, в которых локализованы
поверхностные антигены вируса гриппа, что позволяет считать Совидон перспективным адъювантом для инактивированной гриппозной вакцины.
3.3. Выбор оптимальной дозы адъюванта
Апробировали две дозы адъюванта - 250 и 500 мкг. Исследования по безопасности и иммуногенности экспериментальных вакцин проводились на нелинейных белых мышах (m = 10 - 12 г) и беспородных хорьках (m = 1100 –
1500 г),
серонегативных (титр специфических антител менее 1:10) по отношению к вакцинным штаммам вируса гриппа типов Аи В. При этом основным критерием выбора дозы адъюванта являлась иммуногенность исследуемых вакцин, которую определяли по среднегеометрическим титрам
(СГТ) антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) к штаммам вирусам гриппа, входящим в состав тривалентной вакцины.
Мышам вакцины вводили внутримышечно двукратно по 0,5 мл с
интервалом 7 суток, хорькам - однократно внутримышечно по 0,5 мл. Мыши (n
= 132) были распределены в 4 группы:
1 группа – вводили вакцину Совигрипп (Совидон 500 мкг) (n = 36);
2 группа – вводили вакцину Совигрипп (Совидон 250 мкг) (n = 36);
3 группа – вводили безадъювантную инактивированную гриппозную вакцину (n = 36);
4 группа – вводили однократно 0,5 мл физиологического раствора (n Хорьки (n = 80) были распределены следующим образом:
1 группа – вводили вакцину Совигрипп (Совидон 500 мкг) (n = 20);
2 группа - вводили вакцину Совигрипп (Совидон 250 мкг) (n = 20);
3 группа - вводили препарат Совидон 500 мкг (n = 10);
4 группа - вводили препарат Совидон 250 мкг (n = 10);
5 группа - вводили вакцину Гриппол (n = 10);
6 группа - вводили физиологический раствор (n = 10).

69
3.3.1. Изучение безопасности экспериментальных инактивированных
гриппозных вакцин и препарата Совидон
Наблюдение за мышами и хорьками на протяжени всего эксперимента не выявило никаких отклонений в поведении и соматическом статусе животных опытных групп по сравнению с группой плацебо.
Мышей взвешивали до введения препарата, на 7 и 14 сутки,
статистически значимых отклонений от контрольной группы ив динамике обнаружено не было (p > 0,05) (данные не представлены. Хорьков взвешивали до начала исследования, на 14 и 21 сутки после введения препарата водно и тоже время, данные представлены в таблице 8.
Таблица 8 - Влияние однократного внутримышечного введения гриппозных вакцин на массу тела хорьков
Препараты
Масса тела хорьков в группе (M ± m), кг до вакцинации на 14 сутки после вакцинации на 21 сутки после вакцинации
Вакцина Совигрипп
(Совидон 500 мкг ± 0,36 1,39 ± 0,34 1,41 ± Вакцина Совигрипп
(Совидон 250 мкг ± 0,12 1,30 ± 0,12 1,32 ± Препарат Совидон (500 мкг ± 0,12 1,33 ± 0,13 1,34 ± Препарат Совидон (250 мкг ± 0,21 1,34 ± 0,08 1,38 ± Вакцина Гриппол
1,30 ± 0,06 1,28 ± 0,07 1,31 ± Физиологический раствор ± 0,13 1,30 ± 0,13 1,28 ± Примечание уровень значимости p ˃ При использовании парного критерия Стьюдента с поправкой
Бонферрони для каждой группы отдельно, гипотеза Но том, что средние значения массы тела животных до вакцинации, на 14 сутки и на 21 сутки после введения препаратов не различаются, не была отвергнута (р > Из этого следует, что введение исследуемых препаратов не приводило к статистически значимому изменению веса хорьков на протяжении 21 суток.
Соответственно, введение исследуемых препаратов хорькам не приводит ник ожирению, ник резкой потере веса, что свидетельствует об отсутствии токсического действия.
Для изучения возможной пирогенности как препарата Совидон, таки вакцин, в состав которых он входит как адъювант, ежедневно проводили мониторинг температуры тела хорьков с помощью термометров, проверенных в установленном порядке. Средние значения температуры до введения препаратов и после введения представлены в таблице 9.
Таблица 9 - Влияние однократного внутримышечного введения гриппозных вакцин на температуру тела хорьков
Температура тела хорьков в группе (M ± m),
0
С
до введения после введения
Вакцина Совигрипп (Совидон 500 мкг ± 0,29 38,5 ± Вакцина Совигрипп (Совидон 250 мкг ± 0,32 38,5 ± Препарат Совидон (500 мкг ± 0,37 38,5 ± Препарат Совидон (250 мкг ± 0,31 38,5 ± Вакцина Гриппол
38,7 ± 0,30 38,5 ± Физиологический раствор ± 0,30 38,5 ± Примечание уровень значимости p ˃ При использовании парного критерия Стьюдента для каждой группы отдельно, гипотеза Но том, что температура животных до введения препаратов и после введения не различаются, не была отвергнута. Из этого следует, что температура тела животных в опытных и контрольных группах в течение срока наблюдения оставалась в пределах видовой нормы, что позволяет нам говорить об отсутствии пирогенности вводимых препаратов.
Кроме того, в рамках изучения безопасности экспериментальной вакцины проводили исследование пирогенности на кроликах (n = 6; m = 2 - 2,5 кг).
Ректальную температуру измеряли до введения 1 дозы инактивированных
гриппозных вакцин Совигрипп и Гриппол, далее три раза с промежутками в час после введения. Результаты представлены в таблице Сумма повышения температуры у трех кроликов составила 0,8 0
C для вакцины Совигрипп и 0,7 0
C - для вакцины Гриппол. Считается, что препарат не пирогенен, если сумма максимальных повышений температуру трех кроликов ∑Δt меньше или равна 1,2 С, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 С. Полученные данные, представленные в таблице 14, указывают на отсутствие пирогенности у исследуемых вакцин в соответствии с требованиями ГФ XII.
Таблица 10 - Температурная реакция кроликов на введение гриппозных вакцин
№№
кроликов
Температура после введения, Максимальный, подъем температуры,
0
C
До вакцинации час часа часа
Вакцина Совигрипп
1 39,2 39,4 39,4 39,3 0,2 2
39,0 39,2 39,2 39,3 0,3 3
38,9 39,2 39,0 39,2 Вакцина Гриппол
4 38,9 39,0 39,1 39,2 0,3 5
39,0 39,2 39,3 39,2 0,3 6
39,2 39,2 39,3 39,2 Таким образом, в исследованиях на хорьках и кроликах было показано отсутствие пирогенности как для препарата
Совидон, таки для инактивированных гриппозных вакцин его содержащих.
Для исследования возможного негативного влияния однократного введения препаратов на органы и системы органов животных на 21 сутки после начала исследования была проведена некропсия хорьков, участвующих в эксперименте,
с последующим макроскопическими микроскопическим анализом.
Состояние внутренних полостей, органов и тканей животных опытных и контрольной групп не отличалось. Масса органов хорьков всех групп находилась в пределах видовой нормы.
В результате проведенных гистологических исследований установлено отсутствие специфических патологических изменений у лабораторных животных, получавших как вакцины, таки препарат Совидон в дозировках и 500 мкг.
Слизистая кишечника была сохранена на всем протяжении.
Наблюдавшийся умеренный отек подслизистого слоя был характерен для всех животных, как опытных, таки контрольной групп, и не был связан с введением препаратов (рис. 13). На снимке Е также показан фрагмент прилежащей к стенке кишки поджелудочной железы, структура ее сохранена, патологических особенностей не обнаружено.
А Б В
Г
Д
Рисунок 13 - Гистологические срезы слизистой кишечника хорьков (окраска гематоксилин- эозином) из группы получавших:
А - вакцину Совигрипп (Совидон 500 мкг. Увеличение х400;
Б - вакцину Совигрипп (Совидон 250 мкг. Увеличение х400;
В - препарат Совидон (500 мкг. Увеличение х400;
Г - вакцину Гриппол Увеличение х400;
Д - физиологический раствор. Увеличение х400.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
Участи животных опытных и контрольной групп наблюдали умеренный перицеллюлярный отек, полнокровие мягкой мозговой оболочки, у некоторых с периваскулярными кровоизлияниями. Скорее всего, подобные изменения были вызваны передозировкой препарата Золетил-100, который использовали для эвтаназии животных в высокой дозе до полного угнетения основных функций центральной нервной системы (рис. А Б В
Г Д
Рисунок 14 - Гистологические срезы головного мозга хорьков (окраска гематоксилин- эозином):
А – ядра зрительного бугра хорька получившего вакцину Совигрипп (Совидон 500 мкг).
Увеличение х400;
Б - ядра зрительного бугра хорька получившего физиологический раствор. Увеличение х400;
В – просвет желудочка с хориальным сплетением хорька получившего препарат Совидон
(500 мкг. Увеличение х400.;
Г - борозда, разделяющая извилины хорька получившего вакцину Гриппол. Увеличение х400;
Д – борозда, разделяющая извилины с периваскулярным кровоизлиянием у хорька контрольной группы. Увеличение х400.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
Строение печени всех животных находилось в пределах видовых и возрастных особенностей в некоторых случаях имелась вакуолярная или жировая дистрофия гепатоцитов. Участи животных, как в опытных, таки в контрольных группах в большей или меньшей степени был выражен мускатный
рисунок печени. Данные изменения носили неспецифический характер, несвязанный с введением препаратов (рис. 15).
А
Б
В
Г
Д Е
Рисунок 15 - Гистологические срезы печени хорьков (окраска гематоксилин-эозином) из группы получавших:
А – физиологический раствор. Увеличение х200.
Б - вакцину Совигрипп с консервантом (Совидон 500 мкг. Увеличение х200;
В – вакцину Совигрипп без консерванта (Совидон 500 мкг. Увеличение х200;
Г – препарат Совидон (500 мкг. Увеличение х200;
Д - вакцину Гриппол. Увеличение х200;
Е - физиологический раствор. Увеличение х200.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
У всех исследованных групп животных миокард был нормального строения (рис. 16). На рисунке 17 показано место прокола миокарда при взятии крови размозжение мышечных волокон с обширными перифокальными кровоизлияниями.

75
А
Б
Рисунок 16 - Гистологические срезы (окраска пикрофуксином) миокарда хорьков из группы получавших:
А – физиологический раствор. Увеличение х100;
Б - вакцину Совигрипп (Совидон 500 мкг. Увеличение х100.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
Рисунок 17 - Гистологический срез (окраска пикрофуксином) миокарда хорька из группы,
получавшей вакцину Гриппол с участком прокола миокарда. Увеличение х100.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
Также не было отмечено развития специфических патологий в строении бронхолегочного аппарата животных (рис. Обнаруженная вариабельность в строении зародышевых центров в фолликулах селезенки хорьков не несла в себе патологических изменений и отражала лишь индивидуальные иммунологические особенности каждого животного. Было показано, что зародышевые центры в фолликулах селезенки были более выражены у животных, получавших исследуемые вакцины, чем в контрольной группе (рис. На рисунке 19 показано, что структура селезенки сохранена, фолликулы в большинстве случаев обычных размеров со светлыми центрами, занимающими от 1/3 до 1/2 объема фолликула.

76
А
Б В
Рисунок 18 - Гистологический срез легкого (окраска гематоксилин-эозином):
А - Крупный бронх, мерцательный эпителий сохранен, перибронхиальное пространство без особенностей (вакцина Совигрипп (Совидон 500 мкг. Увеличение х400;
Б - Спазмированый бронх, резкое полнокровие сосудов, очаговая эмфизема с разрывами отдельных альвеол и кровоизлияниями в межальвеолярные перегородки (вакцина Гриппол).
Увеличение х400;
В - Нормальное строение легкого (физиологический раствор. Увеличение х200.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - ВЦ 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 1-7 1-8 1-9
Рисунок 19 - Гистологический срез селезенки хорьков (1 - 9), получавших вакцину
Совигрипп (Совидон 500 мкг) (группа № 1) (окраска гематоксилин-эозином). Увеличение х. (Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» -
«ВЦ»)
На рисунке 20 структура селезенки также сохранена, фолликулы обычных размеров со светлыми центрами, занимающими 1/3 объема фолликула, пульпа умеренно полнокровная 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9
Рисунок 20 - Гистологический срез селезенки хорьков (1-9), получавших вакцину Совигрипп
(Совидон 250 мкг) (группа № окраска гематоксилин-эозином).
Увеличение х250.
(Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
На рисунке 21 - структура селезенки сохранена, фолликулы обычных размеров со светлыми центрами, занимающими 1/3 объема фолликула, пульпа умеренно полнокровная, в случаях 3-1 и 3-7 зародышевые центры не выражены 3-2 3-3 3-4 3-5 3-6 3-7 3-8 3-9
Рисунок 21 - Гистологический срез селезенки хорьков (1-9), получавших препарат Совидон
(500 мкг) (группа № 3) (окраска гематоксилин-эозином). Увеличение х. (Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
На рисунке 22 - структура селезенки сохранена, фолликулы обычных размеров со светлыми центрами, занимающими 1/8 часть объема фолликула,
пульпа в части случаев умеренно полнокровная 4-2 4-3 4-4 4-5 4-6 4-7 4-8 4-9
Рисунок 22 - Гистологический срез селезенки хорьков (1-9), получавших препарат Совидон
(250 мкг) (группа № 4) (окраска гематоксилин-эозином). Увеличение х. (Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
На рисунке 23 - структура селезенки сохранена, фолликулы обычных размеров со светлыми центрами, занимающими 1/3 объема фолликула, пульпа умеренно полнокровная 5-2 5-3 5-4 5-5 5-6 5-7 5-8 5-9
Рисунок 23 - Гистологический срез селезенки хорьков (1-9), получавших вакцину Гриппол
(группа № 5) (окраска гематоксилин-эозином). Увеличение х. (Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
В группе, получавшей плацебо (рису исследованных животных были наименее выражены зародышевые центры фолликулов по сравнению с группами, получавшими вакцины, в целом структура органа полностью сохранена.

81 6-1 6-2 6-3 6-4 6-5 6-6 6-7 6-8 6-9
Рисунок 24 - Гистологический срез селезенки хорьков (1-9), получавших физиологический раствор (группа № 6) (окраска гематоксилин-эозином). Увеличение х. (Препараты предоставлены сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ»)
Таким образом, было показано, что однократное внутримышечное введение адъюванта Совидон в обеих дозировках и гриппозных вакцин с совидоном нетоксично для хорьков.
Также, исходя из наличия и объема зародышевых центров фолликулов селезенки, можно сделать предположение о том, что исследуемые вакцины способны стимулировать антителогенез (Kulkarni et al., 2014).

82
3.3.2. Сравнительное изучение иммуногенности вакцины Совигрипп с
содержанием различных дозировок препарата Совидон
На первом этапе была проведена сравнительная оценка антигенной активности двух адъювантных вакцин с различным содержанием Совидона и аналогичной вакцины без адъюванта при двукратной внутримышечной иммунизации мышей. Показано увеличение СГТ сывороточных антител в группе вакцины с адъювантом в дозе 250 мкг в 2,8; 2,5 и 1,4 раза в группе вакцины с адъювантом в дозе 500 мкг - в 4,5; 2,5 и 1,6 разв отношении вирусов гриппа Аи В соответственно (табл. 11).
Таблица
11
-
Показатели антигенной активности экспериментальных гриппозных вакцин при двукратном внутримышечном введении мышам
*Примечание: р ˂ 0,05 по отношению к экспериментальным группам мышей,
иммунизированных вакциной Совигрипп
При использовании критерия Краскела-Уоллиса гипотеза Но том, что среднее геометрическое титра антител в сыворотках животных привитых вакцинами не отличались от контроля, была отвергнута (р) в отношении всех штаммов. Таким образом, было показано, что иммунизация животных гриппозными вакцинами способствует нарастанию титра антител.
Препарат
Среднегеометрические титры сывороточных антител в РТГА, обратные величины
А (НА (Н
3
N
2
)
В
Совигрипп (Совидон
500 мкг) (n = 36)
507,96 570,18 89,80
Совигрипп (Совидон
250 мкг) (n = 36)
320,00 570,17 80,00
ИГВ без адъюванта (n =
36)
113,4*
226,27 Физиологический раствор = 24)
14,14 14,14 12,60
Изучение иммунологической эффективности вакцин на хорьках проводилось путем сопоставления титров специфических антител в сыворотках крови привитых животных до вакцинации, на 14 и 21 сутки после иммунизации. На момент вакцинации у всех хорьков титр специфических антител к вирусам гриппа типа Аи В в РТГА был ниже 1:10, что говорило об их серонегативности к вакцинным штаммам вируса гриппа. Полученные результаты по иммуногенности представлены в таблице 12.
Таблица 12
-
Показатели иммуногенности вакцин при однократном внутримышечном введении хорькам
Вакцина
Вирус гриппа
Среднегеометрические титры сывороточных антител в
РТГА, обратные величины до введения на 14 сутки на 21 сутки
Вакцина
Совигрипп
(Совидон
250 мкг) (n = В 1:9 А А 1:11 1:19*
@
Вакцина
Совигрипп
(Совидон
500 мкг) (n = В 1:11 А А Вакцина Гриппол
(n = В 1:12 А А 1:12 Физиологический раствор (n = В 1:5 А 1:5 А 1:5 Примечание * - статистически значимое отличие от группы контроля, уровень значимости p ˂ 0,05; # - статистически значимое отличие от группы препарата сравнения, уровень значимости p ˂ 0,05; @ - статистически значимое отличие между группами Вакцина

84
Совигрипп (Совидон 250 мкг) и Вакцина Совигрипп (Совидон 500 мкг, уровень значимости p ˂ При использовании критерия Краскела-Уоллиса гипотеза Но том, что среднее геометрическое титра специфических антител на 21 сутки после введения вакцины Совигрипп или Гриппол не отличались от контроля, была отвергнута (р) в отношении всех штаммов. Таким образом, было показано нарастание титра специфических антител после вакцинации. Кроме того, уже на 14 сутки наблюдались статистически значимые (р) нарастания тиров в отношении некоторых штаммов, по сравнению с контролем (см. табл. 8).
Иммуногенность вакцины Совигрипп (Совидон 500 мкг) была значительно выше, чему вакцины Совигрипп (Совидон 250 мкг) в отношении штаммов вируса гриппа типа Ар критерий Манна-Уитни)
Гипотеза Но том, что среднее геометрическое титра специфических антител на 21 сутки после введения вакцины Совигрипп (Совидон 500 мкг) и
Гриппол не отличались, при использовании критерия Манна-Уитни, была отвергнута (р) в отношении штамма вируса гриппа подтипа А
(H3N2)
Таким образом, на 21 сутки иммуногенность вакцины Совигрипп
(Совидон 500 мкг) была достоверно выше, чем вакцины Совигрипп (Совидон
250 мкг) и вакцины Гриппол в отношении штамма вируса гриппа типа Ар ˂ 0,05; критерий Манна-Уитни).
Кроме того, представлялось интересным оценить процентное соотношение животных с защитным уровнем сывороточных антител (АТ) и выше на 21 сутки после введения вакцин. Входе анализа было показано, что на 21 сутки после однократного внутримышечного введения вакцины Гриппол защитный титр антител к вирусу гриппа типа A(H1N1) был достигнут у хорьков, к вирусу гриппа A(H3N2) - у 70%, к вирусу гриппа В - у животных. Для вакцины Совигрипп с содержанием адъюванта 250 мкг – 25%,
85% и 10%, соответственно, а для вакцины Совигрипп с содержанием адъюванта 500 мкг – 50%, 95% и 30%, соответственно (рис. 25).
Таким образом, поданным изучения иммуногенной активности и безопасности экспериментальных вакцин для дальнейших исследований была выбрана вакцина с дозой адъюванта Совидон, равной 500 мкг.
Рисунок 25 - Процентное соотношение животных с защитным уровнем АТ 1:40 и выше по отношению к штаммам вируса гриппа Аи на 21 сутки после введения вакцин
В ходе дальнейших доклинических исследований на лабораторных животных (нелинейные белые мыши и крысы, мыши линии с, морские свинки, кролики породы Шиншилла, неполовозрелые нелинейные белые крысы, было показано отсутствие острой и хронической токсичности вакцины
Совигрипп, местно-раздражающего, иммунотоксического и аллергизирующего действия, а также пирогенности, репродуктивной и эмбриональной токсичности (данные не приводятся. Полученные результаты позволили перейти к следующему этапу – клиническому исследованию инактивированной гриппозной вакцины Совигрипп (Совидон 500 мкг) на добровольцах в возрасте от 18 до 60 лет.

86
3.4. Клинические исследования гриппозной инактивированной вакцины
Совигрипп
3.4.1. Переносимость, реактогенность и безопасность вакцины Совигрипп
Любая вакцина, вводимая человеку, обладает определенной степенью реактогенности, выражающейся в виде поствакцинальных реакций
(нежелательных явлений. Как правило, такие состояния отражают развитие специфического иммунитета. Они кратковременны, проходят самостоятельно и не требуют врачебного вмешательства. Наряду с развитием адаптивного иммунитета при вакцинации происходят изменения неспецифического характера, которые касаются морфологии и белкового состава крови,
ферментативной активности, свертывающей системы крови, функции надпочечников и других эндокринных органов. Эти изменения, как правило,
также не имеют патологического характера, и продолжаются от нескольких дней до 1 − 2 нед, в редких случаях до 2 месяцев (Медуницын и Покровский,
2005).
Переносимость, реактогенность и безопасность инактивированной гриппозной вакцины Совигрипп изучалась при участии 330 добровольцев возрастом от 18 до 60 лет (средний возраст 31,4 ± 11,6 лет, данные по двум из них (1 – иммунизированный вакциной Совигрипп без консерванта и 1 вакциной Гриппол) небыли приняты к статистической обработке, вследствие появления интеркуррентной инфекции.
Добровольцам однократно внутримышечно вводили одну дозу (0,5 мл) вакцины Совигрипп
(с консервантом или без консерванта) или вакцины Гриппол или эквивалентный объем плацебо (физиологический раствор).
Суммарные данные по количеству добровольцев (%), у которых были отмечены местные и системные реакции в течение 7 дней после вакцинации,
представлены на рисунке 26. В группе плацебо нежелательных явлений отмечено не было.

87
Рисунок
26
-
Количество добровольцев (%), у которых были зарегистрированы предвиденные местные и системные нежелательные явления в течение 7 дней после вакцинации
При использовании критерия
Краскела-Уоллиса,
гипотезы Н
0
об отсутствии различий в частоте местных и системных реакций между группами добровольцев, получавших вакцины Совигрипп, Совигрипп (б/к), Гриппол или плацебо небыли отвергнуты (р > 0,01). Из этого следует, что частота местных и системных реакции у добровольцев, получавших плацебо и добровольцев,
получавших гриппозные вакцины, не имела статистически значимого различия,
что говорит о хорошей переносимости и низкой реактогенности исследуемых вакцин.
Отмечалось преобладание местных реакций в структуре всех выявленных нежелательных явлений после введения вакцины Совигрипп (67 %), которые в % случаев были представлены появлением кратковременного дискомфорта
(болезненности) вместе введения. Аналогичная картина наблюдалась и при введении вакцины Гриппол – 83,3 % местные реакции, из них в 80,0 % - появление кратковременного дискомфорта (болезненности) вместе введения % - гиперемия.
Входе клинического исследования небыли выявлены местные и системные реакции сильной степени выраженности, хотя была отмечена одна местная реакция (болезненность вместе введения) средней степени - при иммунизации вакциной Совигрипп (б/к). Данная реакция носила транзиторный характер и не регистрировалась уже на второй день, терапия не назначалась.
Все реакции, как местные, таки системные, в том числе и средней степени выраженности, не требовали лечения и имели транзиторный характер.
Средние показатели биохимического и общего анализа крови представлены в таблицах 13 и 14. При использовании дисперсионного анализа для повторных наблюдений гипотеза Но сходстве средних биохимических и гематологических показателей крови добровольцев до введения препарата, на
7-й и й день после введения не была отвергнута (р > 0,05) для всех групп.
Таким образом, на протяжении всего исследования у добровольцев во всех группах биохимические и гематологические показатели крови претерпевали незначительные изменения, оставаясь в пределах нормальных значений.
Результаты общего анализа мочи добровольцев и данные неврологического осмотра не обнаружили патологических изменений (данные не представлены).
Ни водной из групп добровольцев при анализе уровня общего IgE в сыворотке крови не было обнаружено существенных изменений в динамике (до вакцинации, на й и на й день после вакцинации) (табл. 15). Лица с изначально высоким уровнем IgE были зарегистрированы во всех группах добровольцев. В большинстве случаев высокий уровень IgE объяснялся наличием в анамнезе аллергической предрасположенности пищевого генеза (на цитрусовые) или поллиноза.

89
Таблица 13 - Влияние вакцин Совигрипп и Гриппол на биохимические показатели крови у добровольцев 18-60 лет
Показатели крови до введения препаратов на 7 сутки после вакцинации на 21 сутки после вакцинации
Сови- грипп n=110
Сови- грипп (б/к)
n=109
Грип- пол Плацебо n=30
Сови- грипп n=110
Сови- грипп (б/к)
n=109
Грип- пол Плацебо n=30
Сови- грипп n=110
Сови- грипп (б/к)
n=109
Грип- пол Плацебо n=30
АЛТ
23,1±
1,5 24,5±
2,0 22,1
±1,0 26,4
±2,0 22,2
±1,3 23,8
±1,4 23,6
±1,0 25,4
±2,0 24,9
±1,9 25,5
±1,7 23,4
±1,4 30,1±
2,3
АСТ
24,2±
1,3 24,6±
1,4 21,3
±0,9 26,8
±1,6 24,7
±1,3 24,3
±1,0 22,9
±1,0 27,4
±1,7 25,9
±1,3 25,4
±1,7 25,9
±1,9 Билирубин общий 11,7±
0,9 12,7
±0,6 11,7
±1,4 11,7
±0,9 14,0
±1,8 13,2
±0,5 12,0
±1,8 13,0
±0,8 12,7
±1,0 14,9
±1,3 14,7±
1,5
Креатинин
77,9±
1,6 77,6±
1,4 80,3
±1,2 78,1
±3,0 79,5
±1,6 77,8
±1,3 79,3
±1,1 81,3
±3,2 80,4±
1,8 79,0
±1,6 78,2
±1,1 Щелочная фосфатаза
95,9±
6,9 99,6±
7,3 95,5
±4,5 105,9
±8,2 99,7
±6,9 96,6
±7,0 101,8
±5,1 103,6
±8,6 97,7
±5,9 103,0
±7,3 92,9
±4,3 Мочевина 4,7±
0,3 4,3
±0,1 4,6
±0,8 4,8
±0,2 4,5
±0,2 4,6
±0,1 5,1
±0,8 4,6
±0,2 4,8
±0,2 4,5
±0,1 Общий белок 71,6±
0,8 73,7
±0,5 72,3
±2,7 72,8
±1,5 72,0
±0,7 73,7
±0,5 71,8
±2,6 72,9
±0,9 72,7
±0,7 73,7
±0,5 71,2
±2,6
СРБ
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
отр.
Глюкоза
5,2±
0,2 5,1±
0,2 5,0
±0,1 5,3
±0,8 5,0
±0,1 5,0
±0,2 5,0
±0,1 5,2
±0,8 5,1
±0,2 5,1
±0,2 5,0
±0,1 Примечание уровень значимости p ˃ 0,05

90
Таблица 14 - Влияние вакцин Совигрипп и Гриппол на гематологические показатели крови у добровольцев 18-
60 лет
Показатели крови до введения препаратов на 7 сутки после вакцинации на 21 сутки после вакцинации
Сови- грипп n=110
Сови- грипп
(б/к)
n=109
Грип пол Плацебо n=30
Сови- грипп n=110
Сови- грипп
(б/к)
n=109
Грип- пол Плацебо n=30
Сови- грипп n=110
Сови- грипп
(б/к)
n=109
Грип- пол Плацебо Гемоглобин 138,5
±2,3 141,6
±1,6 143,7
±5,9 138,1
±2,3 138,6
±2,2 141,1
±1,7 141,0
±5,8 137,5
±2,1 139,3
±2,3 140,2
±1,5 Эритроциты 4,8
±0,4 4,7
±0,1 4,3
±0,9 4,7
±0,1 4,6
±0,2 4,7
±0,1 4,7
±0,8 4,7
±0,1 4,7
±0,1 4,6
±0,1 Лейкоциты 6,3
±0,3 6,6
±0,2 6,0
±0,9 6,9
±0,3 6,5
±0,3 6,8
±0,3 5,9
±0,8 6,5
±0,3 7,2
±0,8 6,6
±0,2 6,5
±0,8
Палочко- ядерные 2,0
±0,2 1,5
±0,1 2,1
±0,9 1,8
±0,2 1,7
±0,2 1,5
±0,1 1,9
±0,9 1,7
±0,2 1,7
±0,2 1,5
±0,1 1,7
±0,9
Сегменто- ядерные 56,8
±1,2 59,1
±0,9 56,5
±2,3 57,1
±1,3 58,0
±1,2 59,1
±0,9 55,3
±2,1 57,5
±1,2 56,2
±1,3 56,6
±1,3 Эозинофилы 2,6
±0,3 2,4
±0,2 2,1
±0,9 2,6
±0,3 2,8
±0,3 2,4
±0,2 2,3
±0,9 2,7
±0,3 2,6
±0,3 2,0
±0,2 Лимфоциты 31,9
±1,1 30,5
±0,8 33,4
±1,7 31,8
±1,3 30,9
±1,1 30,8
±0,8 34,2
±1,4 31,0
±0,9 33,4
±1,1 33,4
±1,0 Моноциты 6,6
±0,5 6,3
±0,3 5,9
±0,9 6,7
±0,5 6,6
±0,4 6,0
±0,3 6,2
±0,9 6,7
±0,4 6,4
±0,4 6,4
±0,5 5,8
±0,9
СОЭ
6,0
±0,7 5,8
±0,8 5,9
±0,6 4,4
±1,0 4,6
±0,5 4,8
±0,8 5,9
±0,7 4,4
±1,0 5,4
±0,6 5,2
±0,7 5,6
±0,5 Примечание уровень значимости p ˃ 0,05

91
Таблица 15 - Уровни IgE в сыворотках крови добровольцев, привитых исследуемыми вакцинами по сравнению с контролем
Сроки взятия проб
Уровни IgE, М ± m, ME/мл
(норма - 1 – 165 МЕ/мл)
Вакцина
Совигрипп
(n = Вакцина Совигрипп
(б/к)
(n = 109)
Вакцина
Гриппол
(n = Плацебо = до введения ± 16,1 90,0 ± 12,0 132,1 ± 26,1 125,8 ± 31,5 7 день ± 14,1 98,9 ± 15,4 135,3 ± 25,7 154,5 ± 30,5 21 день ± 14,8 91,1 ± 13,6 136,9 ± 27,2 149,8 ± Примечание уровень значимости p ˃ При использовании дисперсионного анализа для повторных наблюдений,
гипотеза Н
0
об отсутствии различий в уровне IgE у добровольцев до введения препарата, на 7 и на 21 сутки после введения не была отвергнута (р > 0,05). Из чего следует, что введение препаратов не приводит к повышению уровня IgE и,
следовательно, не увеличивает риск развития аллергических реакций у людей лет при отсутствии специфической непереносимости отдельных компонентов вакцины (например, куриного белка).
В целом полученные данные свидетельствуют о хорошей переносимости и высоком профиле безопасности вакцины Совигрип.
3.4.2. Иммуногенность вакцины Совигрипп
Иммуногенную активность вакцин оценивали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), исследуя парные сыворотки крови 267 добровольцев,
взятые до вакцинации и через 21 день после иммунизации (из них добровольцев получали плацебо и 237 – гриппозные вакцины. Данные еще трех добровольцев (иммунизированный вакциной Совигрипп без консерванта 1 - вакциной Совигрипп с консервантом и 1 – вакциной Гриппол)
не были приняты к статистической обработке, вследствие присоединения интеркуррентной инфекции. Также не учитывались результаты добровольцев,
принявших участие в I этапе исследования, где изучали только переносимость,
реактогенность и безопасность вакцины Совигрипп, за исключением добровольцев, получавших плацебо.
Полученные результаты по иммуногенности вакцин Совигрипп и Гриппол представлены в таблице При использовании критерия Краскела-Уоллиса гипотеза Но том, что уровни сероконверсии и серопротекции, а также фактор сероконверсии на сутки после введения вакцины Совигрипп или Гриппол не отличались от контроля, была отвергнута (р) в отношении всех штаммов. Таким образом,
было показано нарастание титра специфических антител на 21 сутки после вакцинации.
Как видно из таблицы, исследуемые формы вакцины Совигрипп способны обеспечить высокие уровни сероконверсии и серопротекции к штаммам вируса гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Для вакцины Совигрипп с консервантом уровни сероконверсии составили. к штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v - 82,3 % (95%ДИ: 73,9-90,7%);
2. к штамму А/Висконсин/15/09 (H3N2)
-
78,5 % (95%ДИ: 69,4-87,6%);
3. к штамму В/Брисбен/33/08 - 74,7 % (95%ДИ: Для вакцины Совигрипп без консерванта уровни сероконверсии составили. к штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v - 82,3 % (95%ДИ: 73,9-90,7%);
2. к штамму А/Висконсин/15/09 (H3N2)
-
78,5 % (95%ДИ: 69,4-87,6%);
3. к штамму В/Брисбен/33/08 – 77,2 % (95%ДИ: Для вакцины Совигрипп с консервантом уровни серопротекции составили. к штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v - 77,2 % (95%ДИ: 68-86,4%);
2. к штамму А/Висконсин/15/09 (H3N2)
-
70,9 % (95%ДИ: 60,9-80,9%);
3. к штамму В/Брисбен/33/08 - 77,2 % (95%ДИ: Для вакцины Совигрипп без консерванта уровни серопротекции составили. к штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v - 70,9 % (95%ДИ: 60,9-80,9%);
2. к штамму А/Висконсин/15/09 (H3N2)
-
70,9 % (95%ДИ: 60,9-80,9%);
3. к штамму В/Брисбен/33/08 – 74,7 % (95%ДИ: 65,1-84,3%).

93
Таблица 16 - Результаты исследования иммуногенности вакцин Совигрипп и Гриппол у добровольцев 18-60 лет
Препарат
Штамм вируса гриппа
Уровень сероконверсии
СГТ
Фактор сероконверсии
Уровень серопротек- ции
МУ
3.3.2.1758-
03
СРМР ЕМЕА
абс.
%
День День 21
абс.
%
1
*
2
**
3
***
Совигрипп с консервантом = 79)
А/Калифорния/07/09
(H1N1)v
65 82,3 7,1 70,1 9,9 61 77,2
+
+
+
+
А/Висконсин/15/09 (H3N2)
62 78,5 7,2 52,5 7,3 56 70,9
+
+
+
+
В/Брисбен/33/08 59 74,7 9,6 64,2 6,7 61 77,2
+
+
+
+
Совигрипп без консерванта = 79)
А/Калифорния/07/09
(H1N1)v
65 82,3 8,0 62,0 7,8 56 70,9
+
+
+
+
А/Висконсин/15/09 (H3N2)
62 78,5 7,0 51,1 7,3 56 70,9
+
+
+
+
В/Брисбен/33/08 61 77,2 9,2 69,5 7,6 59 74,7
+
+
+
+
Гриппол
(n = 79)
А/Калифорния/07/09
(H1N1)v
63 79,7 7,2 65,4 9,1 59 74,7
+
+
+
+
А/Висконсин/15/09 (H3N2)
60 75,9 7,2 42,2 5,9 52 65,8
+
+
+
-
В/Брисбен/33/08 59 74,7 9,5 55,8 5,9 59 Плацебо (n = 30)
А/Калифорния/07/09
(H1N1)v
3 10,0 6,0 8,1 1,4 3
10,0
-
-
-
-
А/Висконсин/15/09 (H3N2)
5 16,7 6,0 8,3 1,4 1
3,3
-
-
-
-
В/Брисбен/33/08 3
10,0 8,9 10,9 1,2 1
3,3
-
-
-
-
*
- Уровень сероконверсии > 40 %;
**
- Фактор сероконверсии > 2,5;
***
- Уровень серопротекции > 70 %
При этом вакцина Совигрипп не уступала, а по сероконверсии даже превышала значения, полученные по препарату сравнения - вакцине Гриппол.
Для вакцины Гриппол уровни сероконверсии составили. к штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v - 79,7 % (95%ДИ: 71-88,4%);
2. к штамму А/Висконсин/15/09 (H3N2)
-
75,9 % (95%ДИ: 66,5-85,3%);
3. к штамму В/Брисбен/33/08 - 74,7 % (95%ДИ: Для вакцины Гриппол уровни серопротекции составили. к штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v - 74,7 % (95%ДИ: 65,1-84,3%);
2. к штамму А/Висконсин/15/09 (H3N2)
-
65,8 % (95%ДИ: 55,3-76,3%);
3. к штамму В/Брисбен/33/08 – 74,7 % (95%ДИ: Повышение средних геометрических титров антител надень по сравнению с исходным уровнем (фактор сероконверсии) в основном было несколько выше у вакцины Совигрипп (9,9; 7,3; 6,7 и 7,8; 7,3; соответственно, чему вакцины Гриппол (9,1; 5,9; 5,9, соответственно).
При использовании критерия Краскела-Уоллиса для показателей уровня сероконверсии, фактора сероконверсии и уровня серопротекции гипотеза Н
0
об отсутствии статистически значимых различий этих показателей между группами, получавшими гриппозные вакцины, не была отвергнута (р > что говорит о том, что вакцина Совигрипп (как с консервантом таки без него)
не уступает по иммуногенности вакцине Гриппол и может использоваться для эффективной профилактики гриппа улиц от 18 до 60 лет.
Таким образом, низкая частота местных и системных реакций свидетельствует о хорошей переносимости и слабой реактогенности вакцины
Совигрипп. Данные физикального и неврологического осмотров, а также клинического и биохимического анализов крови и анализа мочи не выявили патологических изменений, что указывает на высокий профиль безопасности препаратов. Анализ динамики уровня
IgE показал отсутствие аллергизирующего действия вакцин с адъювантом Совидон.
Вакцина Совигрипп

высокоиммуногенна и удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к инактивированным гриппозным сезонным вакцинам Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (МУ 3.3.2.1758-03) и международным требованиям
(СРМР ЕМЕА). При этом она ни по одному показателю иммуногенности не уступала вакцине Гриппол, а по некоторым даже превосходила ее.
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница