Экспресс-метод анализа стафилококкового энтеротоксина в продуктах питания



Дата02.05.2016
Размер46.5 Kb.
ЭКСПРЕСС-МЕТОД АНАЛИЗА СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ

Любавина И.А1., Шепеляковская А.О.2, Бровко Ф.А.2, Зинченко А.А1., Сидина Е.И. 2,3, Бозиев Х.М. 2, Ламан А.Г. 2, Вертиев Ю.В.4, Гришин Е.В.1

1Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
2Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Московская обл. г. Пущино, Россия
3Пущинский Государственный университет, Московская обл., г. Пущино, Россия

4Государственное учреждение научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия

Стафилококковые энтеротоксины, продуцируемые грамположительными бактериями Staphylococcus aureus, являются наиболее частой причиной пищевых отравлений. Известно несколько серологических типов энтеротоксинов (SE), обозначаемых А, В, С1, С2, С3, D и Е. Механизм действия энтеротоксинов состоит в стимулировании массового высвобождения цитокинов, вызывающих различные токсические поражения центральной нервной системы и ее симпатических отделов, а также нарушение проницаемости стенок кишечника. Все стафилококковые энтеротоксины очень устойчивы к воздействию окружающей среды, включая экстремальные значения рН. Хотя сами клетки стафилококков разрушаются при нагревании, SE термостабильны и выдерживают высокотемпературные обработки с сохранением функциональной активнсти. При благоприятных условиях возможно интенсивное развитие стафилококков и секреция токсинов в самых различных пищевых продуктах (молочные, мясные, рыбные, овощные), наиболее благоприятной средой для развития стафилококков является молоко и молочные продукты, а также мясо и мясные полуфабрикаты.

Наиболее распространен в продуктах питания стафилококковый энтеротоксин А (SEA). В соответствии с методическими указаниями МУК 4.2. 2429-08 развитие стафилотоксикоза у человека вызывает содержание в пищевых продуктах SEA в количестве 100-200 нг и выше.

Основными задачами при диагностике стафилококковых энтеротоксинов является их обнаружение в продуктах питания для контроля качества продуктов и недопущения массовой вспышки заболевания.

Для тестирования продуктов питания на содержание в них SE используют биологические методы (тестирование на животных), различные инструментальные методы (масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография, капиллярный электрофорез и т.д.), а также иммунологические методы анализа (ИФА, метод иммунодиффузии и т.д). В настоящее время наибольшее распространение получили иммунохимические методы тестирования, характеризующиеся высокой чувствительностью и специфичностью. Предел обнаружения SEA с помощью диагностического набора RIDASCREEN® SET A, B, C, D, E (метод качественного ИФА) 0,7 нг/мл. Предел обнаружения метода иммунодиффузии 0,1 мг/мл. Набор RIDASCREEN® SET A, B, C, D, E рекомендован как метод определения SE в пищевых продуктах (МУК 4.2. 2429-08) Роспотребнадзором. В тоже время использование методов ИФА тестирования ограниченно кругом лабораторий, имеющих необходимое оборудование и высококвалифицированных специалистов. Время проведения ИФА составляет несколько часов и для выполнения требуется квалифицированный персонал. Очевидно, что для контроля качества пищевых продуктов производителями, а также сотрудниками контролирующих организаций необходимы методы, простые в исполнении, не требующие сложного оборудования и позволяющие проводить тестирование в короткие сроки и имеющий невысокую стоимость.

Целью нашей работы и являлась разработка одностадийного качественного иммунохроматографического метода тестирования SEA в различных продуктах питания. Иммунохроматографический тест представляет собой иммуноаналитический твердофазный метод, проходящий в формате хроматографии. Его проведение обеспечивает тест полоска, состоящая из нескольких мембран производства фирмы Arista, США. В качестве неподвижной фазы выступают моноклональные антитела, связанные на поверхности тест-полоски. Подвижную фазу образуют анализируемый на содержание SEA образец, в который добавляют вторые антитела, коньюгированные с наночастицами коллоидного золота. Коньюгаты высокостабильны, яркая окраска наночастиц коллоидного золота позволяет визуально оценивать результаты тестирования. Тест проводится в одну стадию, поэтому не требуется дополнительное временя на стадии инкубации и отмывания. Время анализа составляет 15-20 мин. Процедура тестирования не требует использования никакого дополнительного оборудования и отличается простотой, результаты анализа легко интерпретировать. Тест имеет невысокую стоимость. Для его проведения не требуются квалифицированные специалисты. В качестве тестового токсина в работе использовался рекомбинантный SEA, сравнительный анализ проводился также на энтеротоксине А продуцируемом стафилококками. Моноклональные антитела получали по стандартной методике. Специфичность антител на взаимодействие с другими энтеротоксинами стафилококков проверяли в иммуноферментном анализе (ИФА), всего было получено 19 антител. При подборе пар антител для сандвич варианта ИФА проводили биотинилирование антител, анализ проводили в стрептавидин-биотиновой сиситеме. Пары анатител характеризовали по специфичности и чувствительности. Предел детекции в сандвич варианте ИФА составлял 0,5 нг/мл. Полученные пары антител конъюгировали с наночастицами коллоидного золота и отбирали произвольной комбинацией пары пригодные для иммунохроматографиченского определения SEA. В качестве положительного контроля использовали поликлональные овечьи анти-мышинные антитела.

Оценка результатов тестирования качественная, она отвечает на вопрос, содержится или нет токсин в пробе в количестве, превышающем чувствительность теста.

Тестирование проходит при комнатной температуре. Срок хранения теста в течение 1 года.

В результате наших исследований мы создали иммунохроматографический тест, имеющий предел обнаружения 4 нг/мл SEA. Время анализа составляло 15 мин.

Для проверки теста на реальных продуктах, тестирование SEA проводили в образцах 3% молока, 9% творога, яблочного сока, в ветчине, в бутылированной и водопроводной воде и в растворе водно-солевого буфера в качестве контроля. Растворы образцов пищевых продуктов готовили в соответствии с МУК 4.2. 2429-08, а затем вносили в них SEA в различных концентрациях. Предел обнаружения SEA для всех образцов был одинаков и составил 4 нг/мл время анализа при этом составляло 15 минут.

Специфичность тест-системы характеризовали, определяя с ее помощью стафилококковые энтеротоксины А, В, D, C1, E и термолабильный токсин - LT E.coli. В диапозоне концентраций 1 мкг/мл связывания не наблюдали. Полученные результаты говорят о высокой специфичности разработанного метода, позволяющей проводить высокоселективную диагностику.

В качестве контроля на всех этапах разработки теста мы использовали метод сандвич-ИФА. Чувствительность ИФА для определения SEA составляла 0,5 нг/мл.

Таким образом, создан экспресс-метод обнаружения стафилококкового энтеротоксина А в различных пищевых продуктах с помощью иммунохроматографии. Метод прост в применении и оценке результатов, не требует специальных помещений и оборудования и может быть использован в пищевой промышленности и организациях Роспотребнадзора для контроля за качеством продукции.

Мировой опыт показывает, что подобные экспресс-тесты широко используются для контроля качества и безопасности пищевых продуктов. Так, для контроля содержания SEB широко используются иммунохроматографические тесты SEB BioThreat Alert® Kit, Германия (чувствительность 6 нг/мл); SMART™ Staph Enterotoxin B, США



(чувствительность 10 нг/мл); BADD™ (чувствительность 4 нг/мл), США.
Каталог: files -> tezis
files -> Рабочая программа дисциплины Лечебная физическая культура и массаж Направление подготовки 050100 Педагогическое образование
files -> Лечебная физкультура
files -> К рабочей программе дисциплины «Лечебная физкультура и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла Медицинская реабилитация для специальности 310501 «Лечебное дело» по специализации 310501 «Лечебное дело»
files -> Лекции (час) Семинары (час) Самост работа Всего баллов Модуль 1
files -> Влияние мобильного телефона на здоровье человека
tezis -> И. Мечникова Методы оценки и повышения работоспособности у спортсменов Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Санкт-Петербург 2013
tezis -> Сборник трудов конференции 10-11 октября 2014г г. Астрахань ббк 56. 6 И 66
tezis -> Биоэтика в контексте постнеклассической рациональности


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница