Эмбриональная стволовая клетка (от фундаментальной биологии к медицине)



страница1/3
Дата26.04.2016
Размер175 Kb.
Просмотров73
Скачиваний0
  1   2   3
В.С. Репин

Эмбриональная стволовая клетка

(от фундаментальной биологии к медицине)

Любой оптимизм в отношении потенций стволовых клеток должен быть уравновешен трезвой ответственностью в отношении близкой реализации надежд пациента. Пока новая концепция становится реальностью область преждевременно и неизбежно обрастает мифами. Поэтому сама клеточная биология стволовой клетки ничего прямо не может обещать медицине и пациентам.

Немного истории

Хотя термин "стволовая клетка" был введен в биологию Александром Максимовым в 1908 году на съезде гематологического общества в Берлине, статус большой науки эта область клеточной биологии получила в последнее десятилетие ХХ века. В начале 80-х годов ХХ века недифференцированные плюрипотентные линии стволовых клеток были получены из эмбриобласта(внутренней клеточной массы) бластоцисты мыши.( 9. 10, 22 ). Однако ЭСК привлекли всеобщее внимание в 1998 году после изолирования бессмертных линий ЭСК человека Д.Томсоном иД.Герхартом. В 1999 году журнал Science признал открытие ЭСК третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы "Геном человека". Осознание важнейшей роли ЭСК в биологии и медицине состоялось в опережающем режиме, поскольку в открытой печати в 1999 году об ЭСК человека появилось не более 4-5 фундаментальных публикаций ( хотя биологические компании в конце ХХ века уже получили более 2500 патентов на новые технологии и манипуляции с ЭСК). Представляют интерес мотивы и аргументы лидирующих биологов, поставивших открытие ЭСК так высоко в истории биологии ХХ века.

Открытие двойной спирали ДНК изменило мышление в биологии, потому что материализовало силы и законы генетики в биологии. Уотсон и Крик впервые ввели в научный обиход новый термин - информационные молекулы. Они расшифровали , где наследственная информация хранится и как она работает. Устройство молекулы ДНК объяснило ее главные функции. Тот же Уотсон, комментируя через пол-века открытие ЭСК, заметил что устройство стволовой клетки (wet-ware) не дает прямых ключей к расшифровке программы функционирования (soft-ware) ЭСК. Один молекулярный поток информации от ДНК через мир мРНК в трехмерный мир белков не объясняет алгоритма стволовых клеток, поскольку под влиянием внешних инструкций одна ЭСК может превратиться в зародыш, либо в линию специализированных соматических клеток. В случае эмбриогенеза функцию мессенджера-кассет информации на языке мРНК обеспечивают клетки провизорных органов с так называемым "минимальным фенотипом". Эти клетки действительно являются минидискетами информации в виде наборов мРНК, которые не трансформируются в устройство (фенотип) клеток. Клетки провизорных органов зародыша существуют короткое время только для переноса и реализации программ эмбриогенеза. Эти провизорные клетки без белкового фенотипа занимают то же промежуточное место в эмбриогенезе, как мРНК в передаче информации от ДНК в мир белков. В случае созревания ЭСК в специализированную клеточную линию прогениторные и бластные популяции клеток также выполняют роль переносчиков информации на языке мРНК в терминально специализированные клетки.

Эволюция манипулирует одной исходной тотипотентной клеткой, которая с помощью внешней информации подгоняет свое устройство для наиболее адэкватной функции, которая реализуется белковыми машинами. С помощью информации устройство клеток наиболее эффективно подгоняется под контекст местных химических условий ( прежде всего ассортимент молекул микроокружения для создания потоков энергии и строительных веществ в клетки). Software клеток используется не на энергию активации или модификации внешнего "сырья", а на подгонку рецепторов,ионных каналов и белков-переносчиков к источнику "сырья" за счет создания высокоаффинных распознований и перетаскивания молекул в клетки.

Сеймур Бреннер указал, что открытие ЭСК ведет к самому простому и экономичному способу долгосрочного макромасштабного выращивания специализированных клеток человека. Ранее выращивание клеток человека в плотностях двухмерной первичной культуры на пластике всегда вело необратимой дедифференцировке и утрате полезных функций гепатоцитами, нейронами, мышечными клетками. Только недавно было устновлено, что соматические клетки человека стабильно держат фенотип при плотности 1млрд/мл и при наличии ядра из мезенхимальных клеток. Такое устройство функциональныъ единиц органа можно получить лишь из ЭСК

рекапитулируя эмбриогенез органа.

Культивирование недифференцированных стволовых клеток зародыша мышей стало возможным блягодаря двум техническим новшествам: добавлению leukemia inhibitory factor (LIF) - блокатора дифференцировки клеток. Во-вторых, выращивание стволовых клеток из предимплантационных зародышей требовало слоя фидерных клеток- производных мезенхимы( чаще всего используются фетальные фибробласты первых трех пассажей). На первом этапе изучение стволовых клеток из бластоцисты мышей использовалось в основном для изучения закономерностей органогенеза и получения химерных зародышей. В 1998 году Джеймс Томсон ( Висконсинский университет, США) опубликовал в Science статью о выделении 5 бессмертных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из эмбриобласта бластоцисты человека. (30). Одновременно Джон Герхарт ( Университет Джона Гопкинса, США) в Анналах национальной академии США предложил метод выделении бессмертных линий ЭСК из полового бугорка 4-5 нед фетусов.( 28 ). В 1999 году журнал Science признал открытие ЭСК человека третьим по важности событием в биологии ХХ века ( после открытия двойной спирали ДНК и программы "Геном человека"). Эти кульминационные и полу-сенсационные события вокруг ЭСК в последние годы ХХ века были подготовлены не столько методическим прорывом в культивировании ЭСК, сколько успехами функциональной геномики и клеточной трансплантации. Биологи и генетики впервые получили в руки прототип той "клетки-проматери", которую в процессе длительного отбора эволюция выбрала для повторения вида в каждом новом поколении. Программа тотипотентности существует в ооците, зиготе и бластомерах. Однако эти клетки пока невозможно клонировать и пассировать в количествах, необходимых для анализа профиля мРНК и белкового фенотипа. Фактически ЭСК является уникальным биологическим Розеттским камнем, хранящем коды трехмерной карты зародыша и коды линейной рестрикции специализированных линий в файлах провизорных клеток. Программа развития упакована наборами клеток-предшественников без фенотипических маркеров, которые появляются с началом гаструляции. Информация, собранная на языке мРНК этих провизорных клеток, ждет своего Била Гейтса для расшифровки. Мы кратко проследим ретроспективу событий, чтобы лучше уяснить суть перемен на стыке эмбриологии, клеточной биологии и функциональной геномики.

Ни одна область биологии при своем рождении не была окружена такой сетью предубеждений, враждебности и кривотолков, как ЭСК. На Западе эта область на 10 лет было фактически приватизирована биотехнологическими компаниями из-за "моратория" на федеральную науку вокруг ЭСК. За 10 лет учеными частных компаний было получено более 1500 патентов на различные способы изолирования, культивирования, модификации ЭСК для научно-практических исследований. По причине полной закрытости и обстановки строгой секретности вокруг ЭСК на Западе в обществе превалировало недоверие и предубеждения, особенно на стыке с геномикой, где многие области также остаются предметом публичных дебатов. В нашей стране отсутствие знаний и эффективного государственного контроля привело к тому, что рынок медицинских услуг оказался захваченным псевдотехнологиями. Дилетантское обсуждение проблемы ЭСК начинается с трансплантации и клонирования организмов. Серьезное обсуждение проблемы должно начинаться с клеточной биологии ЭСК. В данном обзоре мы кратко остановимся на главных направлениях и результатах фундаментальной клеточной биологии ЭСК.

Линии ЭСК из тератокарцином

В конце 50-х годов ХХ века Лерой Стивенс , работая в США на грант частной компании, изучал эффекты табака и сигаретной бумаги на частоту возникновения опухолей и другой патологии у линейных мышей. Отрабатывая показатели контрольных животных, он обнаружил необычно высокую частоту возникновения тератокарцином в половых зачатках мышей линии 129. В этих опухолях спонтанно возникали клетки нервной системы, кожи, клетки волос, хряща, фрагменты костной ткани и другие неорганизованные массы дифференцированных клеток. Несколько лет Стивенс занимался скрещиванием и селекцией мышей 129 для получения суперлинии с максимальной частотой развития спонтанных тератокарцином. Пассируя спонтанно возникшие опухоли через несколько поколений животных, Стивенс получил более однородную популяцию раковых клеток с удивительными свойствами. ( 20 ). При введении в брюшную полость клетки они формировали крупные клеточные агрегаты, в которых копировались фрагменты эмбриогенеза ( образование скелетной мышцы, сердца, кожи, волос, нервной ткани, кости, мышц). В культуре клетки тератокарциномы также обнаруживали "аномалии поведения": росли неприкрепленными к подложке клонами плюрипотентных клеток, способных дифференцироваться в разнообразные линии соматических специализированных клеток. Стивенс первым показал, что химический состав асцитной жидкости, а также добавленные дифференцированные клетки и ткани влияли на образование специализированных клеточных линий из незрелых клеток тератокарциномы. Стивенс выявил сходство клеток тератокарциномы с клетками эмбриобласта предимплантационных зародышей. Он первым получил тератокарциномы , вводя суспензию клеток эмбриобласта в ткани взрослых мышей. Выросшие опухоли, возникшие после трансплантации клеток эмбриобласта, были переведены в линии. При введении в брюшную полость крыс-реципиентов эти незрелые клетки линии дифференцировались в нейроны, кардиомиоциты и другие соматические клетки- дериваты трех зародышевых листков. Стивенс первым высказал догадку, что работает с смешанной культурой раковых и эмбриональных прогениторных клеток полового зачатка. Эту примесь эмбриональных нераковых клеток он назвал "эмбриональными плюрипотентыми клетками". Позднее удалось подсчитать, что в первичных линиях тератокарциномы содержится не более 0,1% ЭСК. Термин Стивенса "эмбриональная плюрипотентная стволовая клетка" прижился в научной литературе. После Стивенса во многих лабораториях мира было изолировано более 100 линий ЭСК из разных образцов опухолевой ткани.

В середине 70-х годов Беатрис Минтц и Карл Илминси из Ракового института (Филадельфия) первыми получили аллофенных мышей,смешивая клетки тератокарциномы 129 с зародышами на стадии 8- 100 клеток. Было доказано, что донорские гетерогеномные ЭСК эффективно встраиваются в развивающийся зародыш, формируя ростки донорской ткани в костном мозге, кишечнике, коже, печени, кишечнике и других участках зародыша и новорожденных, вплоть до химеризации ткани половых органов. С помощью пересадок ЭСК была налажена технология получения взрослых аллофенных мышей, органы которых были мозаично собраны из собственных/донорских клеток. Этот подход эмбриологи использовали для подсчета числа founder cells, формирующих печень, головной мозг, тимус, кожные покровы и т.п. Имплантация донорских ЭСК в ранний зародыш никогда не сопровождалась малигнизацией тканей или появлением опухолевых клонов ( в отличие от поведения ЭСК в тканях взрослого реципиента).С помощью пересадок ЭСК в ранние зародыши впервые были получены зародыши и взрослые особи- межвидовые химеры типа мышь-крыса, свинья-корова, "гуманизированная" свинья. Нормальный цикл развития проходили только те межвидовые гибриды, в которых донорские ЭСК давали ростки специализированных клонов в органах, но не давали морфологических химер.ЭСК крысы, например, при пересадках в зародыш мыши не влияли на план эмбриогенеза и работу гомеотических генов.

Поскольку линии ЭСК получают из эмбриобласта, это указывает, что генетические потенции стволовых клеток ограничены морфогенезом зародыша. Действительно, плацента и коммуникации зародыша с маткой образуются из клеток трофэктодермы. В виде исключения нормальные зародыши мыши развиваются из донорских ЭСК мыши, помещенных в "матрикс" тетраплоидной морулы, в которой деление клеток было предварительно остановлено цитокалазином. Клетки неделящейся морули не участвуют в построении зародыша, но поставляют ЭСК необходимую информацию.

Следующий методический прорыв был сделан Мариусом Капеччи, разработавшим метод двойного выключения (нокаута) аллельной пары генов в ЭСК мышей. ( техника направленной рекомбинационной делеции генов воспроизводится пока только в ЭСК мышей, но не других видов).( 5 ) При смешивании 60-80 мутантных ЭСК с с 20-30 клетками нормальных предимплантационных зародышей получают развивающуюся химеру, закладки органов которой получают варьирующую долю донорских и реципиентных клеток. Зародыши-химеры позволяют выяснять вклад неизвестных генов в в гаструляции и органогенезе ( часто один ген контролирует разные функции в разных закладках). Компьютерным способом эти данные интегрируются в функциональную карту генов в развивающихся зародышах мыши. На таких мышах-химерах была открыта функция гена SF-1 в закладке надпочечника и половых зачатков; функция Wt-1 гена в закладке почки, генов семейства MyoD в закладке скелетной мышцы, генов семейства GATA-1-4 в рестрикции зачатков эритро- и лимфопоэза. Особо важную роль сыграли ЭСК мышей с двойным нокаутом в расшифровке областей скопления генов на 7-й хромосоме мыши ( практически полной копии скопления генов на 19-й хромосоме человека), а также 16 сМ проксимальный участок 11-й хромосомы мыши ( копия 5q пятой хромосомы человека). Данные по делециям этих генов в ЭСК -\- мышей позволили оценить функции неизвестных генов человека в разных органах.

В настоящее время ЭСК мыши с двойным нокаутом практически любого гена поставляются на рынок биотехнологическими компаниями за 1500-2000 ам.долларов / 2-3 млн клеток. ЭСК с двойной гомоделецией генов оказались наилучшей моделью для изучении функции генов трех зародышевых листков, генов сегментации и гомеозиса. Эмбриология с помощью трансплантации ЭСК быстро продвинулась и по пути получения межвидовых зародышей- гибридов ( мышь-крыса, свинья-корова и т.п.). Зародыши-химеры либо погибали внутриутробно, либо развивались нормально в постнатальном периоде, сохраняя морфогенез вида, клетки которого преобладают в химере. Трансфекция неизвестных клонированных генов человека и животных в ЭСК мыши также используется для выяснения их функции. За последние годы техника химеризации стала столь эффективной, что пересадки единственной донорской ЭСК в 8-клеточный зародыш вызывает химеризацию нескольких органов ( 27 ). Немецкие специалисты получили "гуманизированную" мышь путем введения гематогенных стволовых клеток человека в бластоцисту ( 12).

В зародышах мыши на стадии органогенеза обнаружены циркулирующие в крови плюрипотентные ЭСК, биологические функции которых только начинают изучаться .С помощью двойных нокаутов гена дистрофина в ЭСК удалось вывести линию мышей, точно копирующую мышечную дистрофию Дюшенна человека. С помощью выключения гена АТМ ( контролируюшего синтез сигнальной киназы хроматина) в ЭСК удалось получить линию мышей, копирующую фатальную наследственную болезнь детей-атаксию-телангэктазию. При этом наследственном заболевании наблюдается дегенерация клеток Пуркинье в мозжечке, инволюция тимуса из-за быстрой гибели пролиферирующих клеток ( на почве дефектов репарации ДНК). Клинические, физиологические и морфологические симптомы заболевания точно копируются на мышах-химерах, полученных с помощью ЭСК, привносящих в зародыш информацию о болезни). Практически подавляющую часть наиболее распространенных наследственных гомозиготных заболеваний человека сейчас удается копировать на " нокаутированных" мышах (болезни углеводного, липидного обмена, болезни катаболизма аминокислот, выведения меди, билирубина и т.п.) . Медицина пополнилась обширным каталогом новых лабораторных "болезней" животных, которые в основном используются на стадии предклинических исследований.

Огромное влияние на развитие концепции эмбриональной стволовой клетки оказали программа "Геном человека", открытие , изолирование и секвенирование более 5000 генов эмбриогенеза человека, млекопитающих, дрозофилы, червей, функция которых во многом остается неизученной. Трансфекция неизвестных генов в геном ЭСК мышей оказалась весьма полезным инструментом для грубой оценки функции новых клонированных генов развития. Например, перенос гена Crypto человека позволил идентифицировать стадию его участия в закладке и формировании кардиогенной мезодермы мыши. Перенос клонированного гена человека Рах-6 в мышцу или рыхлую соединительную ткань мыши индуцировал образование "лишнего" глаза мыши. Этим способом было установлено, что донорский Рах-6 ген человека (либо дрозофилы) в организме мыши всегда индуцировал образование глаза реципиента ( но не донора). Серийный анализ генной экспрессии ( serial assay of gene expression) был использован несколькими фирмами для изучения карты экспрессии генов в незрелых пролиферирующих ЭСК тератокарциномы и бластоцисты мыщей.(16) Эти приватизированные данные нигде официально не опубликованы. Однако косвенные ссылки на эти работы подтверждают, что в ЭСК экспрессированы все 1000 генов, относящиеся к энергетическому и метаболическому блоку ( здесь особых различий с специализированными гомогенотами клеток не обнаружено). Однако подавляющая часть (90%) генов транссигнализации, координирующих работу рецепторов и экспрессию генов в ядре, оказалась репрессированной. (16) В специализированных клетках-гомогенотах экспрессировано порядка 500 генов транссигнализации.

Главные источники ЭСК млекопитающих и человека

Для лабораторных исследований линии мышиной тератокарциномы ( 129/sv, F19, F8, JM-1, E14TG2a, Zin 40, CGR 86, R1, CCE) и тератокарциномы человека (NTERA-2, TERA-2, H-9 clone, линии ЭСК Траунсона ( Австралия) остаются наиболее распространенной и воспроизводимой клеточной моделью. Более 100 коммерческих линий ЭСК -производных тератокарцином мышей и человека продаются биотехнологическими компаниями с подробным клеточным пасспортом (иммунофенотип, хромосомный анализ, профиль экспрессии мРНК, профиль экспонированных рецепторов и белков внутриклеточной сигнализации). Существенным недостатком некоторых линий ЭСК тератокарцином является быстрая утрата тотальной потентности в пассажах. Вторым недостатком тератокарцином являются их ограниченные возможности в клинике. Третьим недостатком ЭСК из тератокарцином является смешанная дифференцировка клеток в культуре, трудность получения одной специализированной линии клеток. Поэтому не прекращался поиск ЭСК из других источников.

В 1998 году Джеймс Томсон ( Висконсинский университет, США) изолировал несколько линий бессмертных ЭСК из бластоцисты человека (30). Источником ЭСК послужили предимлантационные зародыши, остающиеся неиспользованными для создания беременности. после процедуры суперовуляции и дублирования стадии искусственного оплодотворения. Зародыши для получения ЭСК обязательно замораживают.В питательной среде Дульбекко-Игл 5-10 зародышей с помощью микроманипулятора разделяют на эмбриобласт и трофобласт, собирают клетки эмбриобласта, визуализируя их с помощью меченых антител. ( Рис 2 А) Эмбриобласт превращают в суспензию клеток с помощью диспазы/коллагеназы и выращивают в специальной питательной среде с добавлением трех цитокинов (LIF, IL-6, SCF). В отличие от зрелых клеток ЭСК растут клонами, которые диссоциируют повторным пипетированием. Новые клоны возникают в суспендированной культуре через 5-7 дней. Максимальная скорость роста ЭСК достигается повторным суспендированием клонов на стадии 10-15 клеток.( Рис 2 Б) . Каждый клон переносят в микроячейку и выращивают до агрегата из 40-50 клеток. Процедуру повторяют многократно в пассажах, увеличивая объем культуры до плотности 5-10 млн клеток на 6см чашку. Путем пассирования было изолировано 10 бессмертных клонов ЭСК человека, которые через 100 пассажей сохранили высокую теломеразу, высокий темп клеточных делений, минимальный фенотип и тотальную потентность ( способность дифференцироваться в любую из 350 специализированных линий - производных эктодермы, мезодермы и энтодермы.( Дифференцировка ЭСК начинается при смене среды, добавлении сыворотки и элиминации LIF из среды). Обычно дифференцировка начинается с прикрепления клеток к подложке, поскольку цитоскелет и рецепторы адгезии играют важную роль в проведении внешних сигналов в клеточное ядро. При неограниченной пролиферации ЭСК человека устойчиво сохраняли кариотип в пассажах. .

Пролиферация клонов ЭСК в культуре имеет особенности. Каждый клон имеет одну стволовую клетку, которая подвергается асимметричному митозу. Одна из дочерних клеток сохраняет место и статус бессмертной тотипотентной клетки. Вторая клетка делится и дифференцируется в прогениторные слои клеток.( Рис 1) Причем периферические слои клона делятся более интенсивно, чем центральные. Экспоненциальный рост клона затухает из-за гибели краевых клеток, вступающих в ококнчательную диффренцировку. Число клеток в клоне не меняется, когда скорость пролиферации клеток уравновешена скоростью апоптоза и миграции одиночных клеток из клона. Рост клоногенной культуры определяется тремя параметрами: числом клонов в мл, численностью клеток в клоне на общее число клеток в культуре и длительностью роста/обновления клонов в культуре.

В 1998 году Джон Герхарт с сотрудниками ( Медицинская школа университета Джона Гопкинса, США) впервые изолировали бессмертные линии половых прогениторных клеток (ППК) из полового зачатка фетусов 4-5 нед развития.

( 28 ). Ранее Бриджит Хогэн сумела изолировать ППК из полового зачатка мышей. ППК появляются в половом бугорке зародышей путем миграции ППК желточного мешка.(25) Обычно линии ППК выделяли из ткани фетального бугорка 4-5 нед зародышей. Для полной солюбилизации ткань обрабатывали смесью коллагеназы IV-V, гиалуронидазы, ДНК-азы. Основная масса ППК упакована в "купели", собранными из стромальных клеток Сертоли. Клетки Сертоли создают иммунный барьер, специальную микросреду для выживания ППК и сохранения их в неактивном состоянии. Строма необходима для созревания гамет. Первичную культуру ППК выращивали на слое фидера (первый-второй пассаж фетальных фибробластов). Для стимуляции пролиферации ППК в среду культивирования добавляли bFGF, LIF и форсколин (стимулятор уровня цАМФ). В культуру ППК добавляли 15% фетальной сыоротки (HyClone). ППК также размножались клонами ошаренных клеток в суспензии ( 28 ).

Четвертый источник получения ЭСК человека был предложен сотрудниками Гарвардской медицинской школы. Соматическое клетки фетуса с помощью электрического разряда сливали с яйцеклеткой коровы, из которой предварительно удалялся пронуклеус. Такой неприродный гетерогеномный " гибрид" не только без помех проходит предимплантационные стадии развития, имплантируется в матку коровы, но внутриутробное развитие заканчивается рождением нормальных плодов. Метод позволяет получать гибридные бластоцисты, а из них получать ЭСК человека в обход беременности и фетальных тканей. Это позволяет избавляться от биоэтических проблем вокруг фетальной ткани и абортов. Однако ЭСК-цитогибриды породили новые правовые и этические дискуссии . Известно, что введение ЭСК крыс в зародыш мыши заканчивается рождением мыши-химеры, органы которой содержат ростки клеток крысиного происхождения. Не известны потенции, генетические возможности и жизнеспособность "межвидовых" зародышей,собранных из ядра человека и цитоплазмы коровы. Как известно, на манипуляции с зародышами человека наложен мораторий: исследования невозможны в академических учреждениях на деньги налогоплательщиков. Работы с ЭСК-цитогибридами ведутся частными компаниями и держатся в строжайшей тайне ( включая технологии "гуманизации" крупного рогатого скота с помощью ЭСК человека). Правовые, научные, этические аспекты в области межвидовой химеризации зародышей остаются непроработанными. Границы возможного на стыке генома двух видов наукой и обществом пока не установлены. В 2000 году в Австралии, Англии и Японии был отменен мораторий на государственные бюджетные исследования ЭСК человека, включая возможность получения ранних ( 100-120 клеточных) "межвидовых" цитогибридов типа "человек-свинья", "крыса-мышь". Это разрешение необходимо для разработки новых источников ЭСК в обход беременности и фетальных тканей. Пересаживая ядро соматической клетки человека в яйцеклетку коровы, получают цитогибридную клетку, которая в культуре повторяет начальные стадии эмбриогенеза и достигает стадии бластоцисты. Далее из этих зародышей выделяют эмбриобласт и получают из него линии бессмертных ЭСК по методу Томсона. Этот метод позволяет получать нелимитированные количества ЭСК из генома "заказчика" и далее их использовать для трансплантации без риска иммунных осложнений. В США по-прежнему существует мораторий на получение бластоцист-межвидовых гибридов.



Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал