Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях 14. 03. 09 Клиническая иммунология, аллергология


Рис. 14. Влияние FGFb (серые столбики) на длительность культиви-рования МСК до субслияния



страница3/4
Дата30.04.2016
Размер2.36 Mb.
ТипАвтореферат диссертации
1   2   3   4

Рис. 14. Влияние FGFb (серые столбики) на длительность культиви-рования МСК до субслияния.

Рис. 15. Влияние FGFb на выход МСК (х106).

Однако возрастание пролиферативной активности МСК в присутствии FGFb приводило к усилению супрессорной активности не во всех случаях. Так, усиление супрессорной активности в присутствии FGFb отмечалось в культурах МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако FGFb не усиливал супрессорную активность МСК больных гемобластозами (рис. 16).












Рис. 16. Влияние FGFb на супрессорную активность МСК в СКЛ. А – МСК доноров, Б – МСК больных ЦП, В – МСК больных АИЗ, Г – МСК больных гемобластозами.

Активация пролиферативной активности МСК в присутствии FGF сопровождалась усилением исходно сниженного остеогенного потенциала этих клеток. Данный эффект однако проявлялся только в культурах МСК больных ЦП, но не регистрировался в культурах МСК больных гемобластозами (рис. 17).






Рис. 17. Влияние FGFb на остеогенный потенциал МСК, оцениваемый полуколичественным методом.

Таким образом, МСК больных с воспалительными и онкогематологическими заболеваниями характеризуются изменениями количества клоногенных предшественников в костном мозге, а также нарушениями пролиферативной, остеогенной и иммунорегуляторной активности МСК в культуре in vitro. Генерация МСК в присутствии основного фактора роста фибробластов повышает их пролиферативный, дифференцировочный и иммуносупрессорный потенциал, что позволяет использовать FGF для стимуляции роста и/или коррекции функциональной активности МСК при патологии.


Ретроспективный анализ ко-трансплантации МСК и ГСК у больных злокачественными лимфомами

Сохранная гемопоэзстимулирующая активность в совокупности со сниженным супрессорным и остеогенным потенциалом МСК у больных гемобластозами послужили обоснованием к использованию МСК для улучшения восстановления гемопоэза при трансплантации стволовых кроветворных клеток. Проведенные исследования показали хорошую переносимость и безопасность МСК, а также достоверное сокращение периода критической цитопении, что позволило зарегистрировать данную технологию. С целью дальнейшего исследования влияния МСК на восстановление гемопоэза на большей выборке, а также для изучения эффектов МСК на особенности восстановления иммунной системы мы сравнили ряд показателей, характеризующих эффективность ТГСК в группах пациентов со стандартной ТГСК и котранспалнтацией МСК. В исследование были включени 125 пациентов, включая 52 пациента с неходжкинской лимфомой, 46 – с лимфомой Ходжкина, 28 – с множественной миеломой, которым проводилась аутологичная трансплантация ГСК в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии НИИ Клинической иммунологии СО РАМН (табл. 3).

Совместное введение ГСК и относительно низких доз МСК (в средней дозе 6,6 млн) приводило к более раннему выходу из лейкопении (в среднем на 11-й день вместо 16-ти суток) и тромбоцитопении (в среднем на 6-ой день вместо 11-ти дней; рис. 18А), к более эффективному раннему восстановлению лимфоцитов (рис. 18Б), более активной реконституции CD4+ лимфоцитов за счет наивных CD4+ Т-клеток (рис. 18В). При этом трансплантация аутологичных МСК не оказывала стимулирующего влияния на реконституцию регуляторных Т-клеток.


Таблица 3

Характеристика больных в исследуемых группах

Параметры

Группы больных

Достовер

ность различий



МСК(-) (n=61)

МСК(+) (n=65)

Возраст, лет

(медиана; min-max)



35 (18-58)

26 (17-55)

рU = 0,23

Пол

- мужчины

- женщины

38 (62%)


23 (38%)

34 (52%)


31 (48%)

χ2 = 0,88



Статус

- полная ремиссия

- частичная ремиссия

- прогрессия


10 (16%)


36 (59%)

15 (25%)


21 (32%)


34 (53%)

10 (15%)

χ2 = 0,15


Количество курсов ХТ

- 1-ой линии

- 2-ой линии

8,3 ± 0,73

1,8 ± 0,2

7,0 ± 0,4

1,6 ± 0,2

рU = 0,54

рU = 0,44


НХЛ

ЛХ

ММ



28 (46%)

19 (31%)


14 (23%)

24 (37%)

27 (42%)


14 (21%)




CD34+ ГСК х 106/кг

(медиана; min-max)



5,94 ± 0,74

(4,4; 2 – 34)



4,6 ± 0,29

(4,4; 1 - 9,6)



pU = 0,25

МСК

(медиана; min-max)





0,16х106/кг

(0,01-1,1х106/кг)






Количество лимфоцитов (х109) в продукте сепарации

(медиана)



11,9 ± 1,9

(10,7)


13,8 ± 1,7

(9,95)


pU = 0,82

Количество лимфоцитов (х109) в периферической крови до ТГСК (медиана)

1,4 ± 0,1 (1,16)

1,6 ± 0,13 (1,4)

рU = 0,24

Количество лимфоцитов (х109) на момент выхода из лейкопении

0,59 ± 0,04 (0,56)

0,68 ± 0,04 (0,69)

рU = 0,21

Примечание: данные представлены в виде M ± S.E. Достоверность различий определяли по χ2 (критерий хи квадрат) и U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Ко-трансплантация МСК ассоциировалась с меньшей частотой развития тяжелых форм инфекционных поражений слизистых (мукозитов и энтеропатий III-IV ст.; рис. 19А) и более эффективным купированием нефротоксического эффекта ПХТ (рис. 19Б).






P=0.004
line 7


Исходный уровень

Через 1 мес после ТГСК
group 8
Исходный уровень
line 12



CD4+FoxP3+

CD4+CD25high


Рис. 18. Влияние ко-трансплантации ГСК и МСК на восстановление гемо/иммунопоэза. А – длительность нейтро- и тромбоцитопении, Б – раннее восстановление лимфоцитов, В – восстановление CD45RA+ Т-лимфоцитов, Г – восстановление регуляторных Т-клеток.

Анализ 3-хлетней общей выживаемости не выявил значимых различий между группами (рис. 20). Кривые 3-хлетней выживаемости принципиально не различались (выживаемость составляла 62-63%) и не выходили на плато, продолжая снижаться при дальнейшем наблюдении в обеих исследуемых группах больных.





P=0,06
line 7 line 7
P=0,08



*


Рис. 19. Влияние ко-трансплантации ГСК и МСК на частоту развития тяжелых поражений слизистых (А) и уровень креатинина (Б).






Рис. 20. Анализ 3х-летней общей выживаемости в группах больных со стандартной ТГСК и ко-трансплантацией ГСК и МСК. Кривые общей выживаемости построены по методу Каплана-Майера. Сравнительный анализ кривых выживаемости проводили с использованием непараметрического Log-rank-критерия.


Заключение

Проведенное исследование позволило охарактеризовать биологическую активность МСК в норме, включая генерированные из костного мозга, плаценты и жировой ткани человека клетки, и при некоторых патологических состояниях (воспалительные и онкогематологические заболевания), а также оценить безопасность и эффективность использования МСК в терапии гемобластозов. Полученные результаты показали, что МСК различного тканевого происхождения в целом отвечают Минимальным критериям Международного общества клеточной терапии, однако имеют определенные тканеспецифические различия по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов, участвующих в поддержании кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.

Исследование свойств МСК при патологии показало, что развитие патологии сопряжено с изменением количественных/фенотипических и функциональных свойств МСК. Так, изменения свойств костномозговых МСК при гемобластозах, аутоиммунных заболеваниях и циррозе печени проявляются снижением количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогенного потенциала в культуре in vitro. Интересными и принципиально новыми можно считать полученные нами данные о корригирующем влиянии основного фактора роста фибробластов (FGFb) и о различной чувствительности МСК к действию FGFb при разных патологиях. Во-первых, генерация МСК больных гемобластозами и воспалительными заболеваниями в присутствии FGFb сопровождается сокращением сроков культивирования, увеличением выхода клеток, а также возрастанием числа циклирующих МСК, что в совокупности свидетельствует о способности FGFb корригировать исходно сниженную пролиферативную активность МСК при патологии. Во-вторых, усиление пролиферативной активности МСК под влиянием FGFb приводит к повышению супрессорного и остеогенного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП). В то же время у больных гемобластозами активация пролиферативных процессов под влиянием FGFb не сопровождается нормализацией иммуносупрессорной активности и остеогенного потенциала, что свидетельствует о резистентности МСК у этой категории больных.

В настоящей работе мы продемонтрировали, что МСК, полученные из костного мозга больных гемобластозами, обладают хорошо выраженной способностью к стимуляции гемопоэза в сочетании со сниженным иммуносупрессорным и остеогенным потенциалом. Эти свойства МСК послужили основанием для клинического применения ко-трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток и МСК в онкогематологии с целью ускорения восстановления гемо/иммунопоэза. Использование ко-трансплантации ГСК и аутологичных МСК является безопасным, поскольку не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов и/или ухудшению показателей выживаемости больных геобластозами, при этом приводит к более быстрому восстановлению показателей гемо/иммунопоэза и позволяет повысить клиническую эффективность трансплантации аутологичных ГСК за счет снижения частоты развития тяжелых инфекционных осложнений и более эффективного купирования ПХТ-индуцированной токсической нефропатии.


ВЫВОДЫ

  1. МСК костного мозга, жировой и плацентарной ткани обладают схожей морфологией, иммунофенотипом и способностью к билинейной дифференцировке, однако различаются по количеству клоногенных прекурсорсоров и пролиферативному/остеогенному потенциалу. Так, ядросодержащие клетки жировой ткани содержат наибольшее количество КОЕ-Ф; популяция МСК плаценты отличается набольшим содержанием относительно мелких клеток (<20 мкм) и выходом клеток из одного клоногенного прекурсора, а также наименьшим временем удвоения клеточной популяции; популяция МСК костного мозга – наибольшей интенсивностью остеогенной дифференцировки.

  2. МСК различного тканевого происхождения обладают сходной гемопоэзподдерживающей активностью, в равной степени стимулируя образование КОЕ-Э и КОЭ-ГМ в культурах костно-мозговых клеток, но различаются по выраженности супрессорной активности, о чем свидетельствует более высокая ингибирующая активность П-МСК (по сравнению с КМ-МСК и Ж-МСК) в смешанной культуре лимфоцитов.

  3. МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, EPO), иммуномодуляции (через продукцию IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-1b, TNF-a и хемокинов – IL-8, MCP-1, MIP-1b) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, MMP-9, TIMP-1). При этом Ж-МСК отличаются наиболее выраженной спонтанной продукцией провоспалительных (IL-1b, TNF-a), иммунорегуляторных (IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1b) и гемопоэзстимулирующих (G-CSF, GM-CSF) медиаторов, но отличаются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции.

  4. Костномозговые мононуклеарные клетки при воспалиетльных и онкогематологических заболеваниях отличаются сниженным содержанием клоногенных прекурсоров МСК, наиболее выраженным у больных лимфомами и АИЗ, и в меньшей степени – у больных ЦП и ММ. При этом выявленная внутригрупповая гетерогенность больных ЦП и АА по количеству КОЕ-Ф является дополнительным признаком патогенетической разнородности данных заболеваний.

  5. Увеличение времени генерации КМ-МСК in vitro, независимо от исходного количества клоногенных предшественников, а также снижение количества «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф, свидетельствует о нарушении пролиферативного потенциала МСК у больных ЦП, АИЗ и гемобластозами.

  6. В отличие от здоровых доноров, МСК больных с иммунопатологическими заболеваниями способны ингибировать пролиферативный ответ активированных Т-лимфоцитов только при добавлении в высоких количествах, тогда как низкие дозы МСК не влияют (при ЦП), либо усиливают (у больных АИЗ и гемобластозами) пролиферативную активность Т-клеток, что свидетельствует о значительном снижении иммуносупрессорных свойств- и появлении иммуностимуляторной активности МСК при ряде патологий.

  7. Супрессорная активность МСК при большинстве исследуемых патологий не коррелирует с продукцией NO, HLA-G, IL-10 или экспрессией IDO, однако в значительной степени (на 42%) снижается при обработке МСК индометацином, а у больных АА существенно блокируется при нейтрализации активности IDO, что свидетельствует об универсальной и значительной роли ПГЕ2 в реализации супрессорного потенциала МСК при различных патологиях и сохранности IDO-опосредованного механизма супрессорной активности МСК при АА.

  8. Добавление основного фактора роста фибробластов (FGFb) на этапе генерации МСК у больных гемобластозами и воспалительными заболеваниями сопровождается сокращением сроков культивирования, увеличением выхода клеток, а также возрастанием числа МСК в S/G2M фазе клеточного цикла, что свидетельствует о способности FGFb корригировать исходно сниженную пролиферативную активность МСК при патологии.

  9. Усиление пролиферативной активности МСК в присутствии FGFb сопровождается повышением супрессорного и остеогенного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако не влияет на супрессорную и дифференцировочную активность МСК больных гемобластозами, что свидетельствует о различной чувствительности МСК к действию FGFb при разных патологиях.

  10. Наличие сопряженности между усилением пролиферации МСК (при обработке FGFb) и восстановлением супрессорного и остеогенного потенциала при воспалительных заболеваниях и отсутствие подобной зависимости при гемобластозах свидетельствует о существовании двух типов функциональных нарушений МСК - зависимом и не зависимом от их пролиферативной активности.

  11. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг) при совместной трансплантации с аутологичными ГСК у больных гемобластозами позволяет сократить сроки критической нейтро- и тромбоцитопении, приводит к более эффективному раннему восстановлению лимфоцитов, более активной реконституции CD4+ лимфоцитов за счет наивных CD4+ Т-клеток и не оказывает стимулирующего влияния на генерацию регуляторных Т-клеток.

  12. Совместное использование МСК и ГСК является безопасным, поскольку не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов и/или ухудшению показателей выживаемости больных геобластозами, и при этом позволяет повысить клиническую эффективность трансплантации аутологичных ГСК за счет снижения частоты развития тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий) и сокращения сроков купирования ПХТ-индуцированной токсической нефропатии.


Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Останин, А.А., Черных Е.Р Супрессорная активность мезенхимальных стволовых клеток костного мозга // Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет».-Цитокины и воспаление.- 2005.- Т. 4, № 2.- С. 114.

2. Dobryakova O.B., Shevela E.Ya., Gulev V.S., Kozlov V.A., Chernykh E.R., Dobryakov B.B.Mesenchymal stem cells separation from lipoaspirate for aging skin rejuvenation // Mat. 10th Congress of European Societies of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. - 2005.- P. 99-100.

3. Черных Е.Р., Пальцев А.И., Старостина Н.М., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я. и др. Роль стволовых клеток в регенерации печени – новые подходы к лечению цирроза печени // Международная конференция «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск). - 2005.- С. 11-12.

4. Черных Е.Р., Пальцев А.И., Старостина Н.М., Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Меледина И.В., Селихова Ю.Б., Демидчик С.Н., Никонов С.Д., Кожевников В.С., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Козлов В.А. Аутологичные клетки костного мозга в комплексном лечении пациентов с хроническими гепатитами и циррозом печени // Гепатология.- 2005.- № 1.- С. 30-36.

5. Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Меняева Е.В., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Морфофункциональная характеристика стволовых клеток костного мозга в норме и при патологии // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - Мед. иммунология.- 2006.- Т. 8, № 2/3.- С. 27-28.

6. Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных циррозом печени // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - Мед. иммунология.- 2006.- Т. 8, № 2/3.- С. 51-52.

7. Chernykh E.R., Shevela E.Ya., Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Ostanin A.A. Characteristics of bone marrow cells under conditions of impaired innervation in patients with spinal trauma // Bull Exp Biol Med.- 2006.- Vo. 141, № 1.- P. 117-120.

8. Черных Е.Р., Шевела Е.Я., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Кулагин А.Д., Пронкина Н.В., Мурадов Ж.М., Ступак В.В., Козлов В.А. Характеристика клеток костного мозга в условиях нарушенной иннервации при травматическом повреждении спинного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине.- 2006.- № 1.- С. 8-11.

9. Черных Е.Р., Старостина Н.М., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Останин А.А., Козлов В.А. Перспективы клинического использования стволовых клеток взрослого человека // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - Мед. иммунология.- 2006.- Т. 8, № 2/3.- С. 188.

10. Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных гемобластозами // Мат. Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - Мед. иммунология.- 2007.- Т.9, №2-3.- С. 283-284.

11. Курганова Е.В., Шевела Е.Я., Останин А.А., Черных Е.Р. Генерация регуляторных Т-клеток in vitro // Мат. Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - Мед.иммунология.-2007.- Т.9., №2-3.-С. 147-148.

12. Черных Е.Р., Старостина Н.М., Пальцев А.И., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Шипунов М.В., Селихова Ю.Б., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Никонов С.Д., Останин А.А., Козлов В.А. Аутологичные клетки костного мозга в лечении цирроза печени // Клеточные технологии в биологии и медицине.- 2007.- № 4.- С. 231-237.

13. Черных Е.Р., Ступак В.В., Мурадов Ж..М., Сизиков М.Ю., Шевела Е.Я., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Козлов В.А. Применение аутологичных костномозговых клеток в лечении пациентов с травматическими повреждениями спинного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине.- 2007.- № .2- С. 109-114.

14. Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Добрякова О.Б., Дробинская А.Н., Останин А.А., Черных Е.Р. Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из разных тканей // Омский научный вестник.-2007.-№3(61).-С.39-42.

15. Шевела Е.Я., Петровский Я.Л., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Сергеевичева В.В., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематология и трансфузиология.- 2008.- № 2.- С. 32-38.

16. Останин А.А., Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Дробинская А.Н., Добрякова О.Б., Лисукова Е.В., Черных Е.Р. Новый подход к оценке остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток // Клеточные технологии в биологии и медицине.- 2008.- № 4.- С. 219-226.

17. Кривошапкин А.Л., Черных Е.Р., Нетесов Е.В., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Козлов В.А. Трансплантация аутологичных костномозговых клеток в лечении церебрального инсульта // Бюллетень сибирской медицины.- 2008.- Т. 8, Прил. 3.- С. 90-96.

18. Курганова Е.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Генерация в культуре in vitro и характеристика регуляторных Т-клеток человека // Мед. иммунология.- 2008.- Т. 10, № .2-3.- С. 173-180.

19. Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Сахно Л.В., Дробинская А.Н, Добрякова О.Б., Останин А.А., Черных Е.Р. Функциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из различных тканей // Сибирский медицинский журнал


Каталог: downloads
downloads -> Современный взгляд на значение ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента в лечении артериальной гипертензии у пожилых
downloads -> Н. И. Доста, А. А. Вальвачев Доброкачественная гиперплазия предстательной железы: новый взгляд на этиопатогенез и лечение. Белмапо, Минск Эпидемиология
downloads -> «Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (аденома)»
downloads -> Плейотропные эффекты статинов при ишемической болезни сердца
downloads -> Фундаментальная наука в современной медицине 2013 : материалы науч практич конф молодых учёных / под ред. А. В. Сикорского, О. К. Кулаги, А. В. Стахейко, Т. В. Тереховой Минск : бгму, 2013 208 с
downloads -> Переход белорусской психиатрии на мкб-10: первые итоги
downloads -> Курс лекций по психиатрии и наркологии (учебное пособие)
downloads -> Министерство здравоохранения республики беларусь


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница