Инструкция по определению витамина a и бета-каротина в пищевых продуктах



Скачать 38.45 Kb.
Дата27.04.2016
Размер38.45 Kb.
ТипИнструкция
Утверждаю
Заместитель Начальника Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Минздрава СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
10 июля 1987 г. N 4400-87
ИНСТРУКЦИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА A И БЕТА-КАРОТИНА В

ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых

продуктов.


Колориметрический метод определения витамина A с треххлористой сурьмой широко

используется для определения содержания витамина A в пищевых продуктах как в нашей стране, так

и за рубежом. Для определения содержания бета-каротина (провитамина A) применяют

спектрофотометрический метод после отделения его от каротиноидов на окиси алюминия или других

адсорбентах.
Методы прошли широкую апробацию в различных лабораториях, отраслевых институтах

пищевой промышленности и кафедр гигиены и питания медицинских институтов, одобрены

Минздравом СССР и рекомендованы для практического использования Междуведомственной

комиссией по составлению таблиц "Химический состав пищевых продуктов".


Принцип метода определения витамина A. Метод основан на реакции витамина A с

треххлористой сурьмой в хлороформе с образованием синей окраски, интенсивность которой прямо

пропорциональна содержанию витамина A. Предварительно проводят щелочной гидролиз жира,

экстракцию витамина A органическим растворителем и отделение его от других соединений с

помощью адсорбционной хроматографии.
Принцип метода определения бета-каротина. Метод основан на измерении интенсивности

светопоглощения растворов бета-каротина. Как соединения с сопряженными двойными связями

каротиноиды имеют характерные спектры поглощения в видимой области. Бета-каротины

экстрагируют органическим растворителем, отделяют от других каротиноидов с помощью

адсорбционной хроматографии и измеряют поглощение его растворов на спектрофотометре при 450 -

452 нм.
При анализе молока, мяса, рыбы и блюд из них, приготовляемых без добавления растительных

продуктов, возможно определение витамина A и бета-каротина из одного экстракта после их

разделения на одной колонке с окисью алюминия. При анализе продукта, состоящего из животного и

растительного сырья, определение витамина A и бета-каротина возможно из одного экстракта, но

после выделения этих соединений на разных колонках.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Оборудование. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания

200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с

наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; роторный

испаритель; водяная баня с закрытым электрическим обогревом; фотоэлектроколориметр;

спектрофотометр; гомогенизатор; шкаф сушильный.
Посуда. Ступка с пестиком; воронки фильтровальные 3; 5 - 7,5 см; воронки делительные

вместимостью 250 - 500 куб. см; колбы мерные вместимостью 50 и 100 куб. см; колбы конические

вместимостью 100 и 250 куб. см; колбы круглодонные вместимостью 50, 100, 250, 500 куб. см со

шлифом 14,5 и 29 мм; холодильник обратный, водяной со шлифом 14,5 мм; хроматографическая

колонка - стеклянная трубка длиной 9 - 11 см, внутренний диаметр 10 мл, в нижний конец колонки

впаяна трубка с внутренним диаметром 5 - 6 мм, постепенно суживающаяся до 1,5 - 2,0 мм, колонка

заканчивается отводом для создания разрежения и шлифом 14,5; пробирки со шлифом 14,5,

градуированные на 5, 10, 15 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; микропипетки

градуированные на 0,1 и 0,2 куб. см; цилиндры мерные на 50, 100, 200 куб. см; стаканы на 50, 100,

250 куб. см.


Реактивы. Ретинола ацетат (Госфармакопея СССР, 10 изд., ст. 578); аскорбиновая кислота

(Госфармакопея СССР, 10 изд., ст. 6); алюминия окись по Брокману II, нейтральная; калия

гидроокись; натрий сернокислый безводный; сурьма треххлористая; фенолфталеин; ацетон; гексан;

спирт этиловый ректификованный; уксусный ангидрид; хлороформ; эфир этиловый; бумага

фильтровальная. При работе с эфиром, ацетоном, гексаном, хлороформом соблюдать правила техники

безопасности с органическими растворителями.


Приготовление реактивов.
1. Стандартные растворы ретинола ацетата с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см и 58

МЕ/куб. см. Растворяют 0,1000 г ретинола ацетата в мерной колбе на 100 куб. см в хлороформе и

доводят хлороформом до метки (раствор с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см). Для

приготовления раствора 58 МЕ/куб. см 1 куб. см раствора с концентрацией 2900 МЕ/куб. см вносят в

мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят до метки хлороформом. Соединения ретинола

ацетата очень неустойчивы к кислороду воздуха и свету, поэтому растворы готовят сразу при

вскрытии ампулы и в день построения калибровочного графика.
    2. Раствор  треххлористой сурьмы (реагент Карр-Прайса).

Отвешивают 20 г


SbCl  в конической колбе вместимостью 250 куб. см, в которую

предварительно


    3
отмерено 100 куб. см хлороформа (в случае большой навески после

взвешивания


добавляют  необходимое  количество  хлороформа) и растворяют при

слабом (не


выше  40  °C)  нагревании на водяной бане, периодически встряхивая.

Раствор
охлаждают,  добавляют  2  -  3  куб.  см  уксусного ангидрида, колбу

плотно
закрывают  и  оставляют  на  ночь для отстаивания. Затем прозрачный
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
раствор
осторожно  сливают  в  темную склянку с плотно закрывающейся крышкой.

SbCl
                                                                         

3
токсична  и  коррозионна,  необходимо  защищать  от  попадания кожу,

глаза,
дыхательные пути.


3. Раствор гидроокиси калия 50%. 50 г KOH растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды.
4. Окись алюминия. Для приготовления окиси алюминия определенной степени активности

отвешивают в бюксе 6 г адсорбента и ставят в сушильный шкаф (t = 160 - 180 °C) на 60 - 90 мин.

Затем окись алюминия дезактивируют, быстро добавляя воду микропипеткой с массовой долей 1%

(0,06 куб. см) или 3% (0,18 куб. см). Бюкс закрывают крышкой и встряхивают до тех пор, пока масса

не станет однородной. Подготавливают адсорбент и заполняют им колонку перед нанесением на нее

исследуемого раствора.


5. Растворы ацетона в гексане 4; 4; 10, 15% (объем/объем).
6. Раствор фенолфталеина (спиртовый) с массовой концентрацией 1%.
Ход определения.
1. Щелочной гидролиз. Интервал определяемых массовых концентраций витамина A составляет

1,5 - 10 МЕ (0,4 - 3,0 мкг)/куб. см хлороформного экстракта, используемого для реакции с

треххлористой сурьмой. Массу навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из

интервала указанных концентраций. Масса навески продукта должна находиться в диапазоне 1 - 20 г

с массовой концентрацией витамина A 2 - 20 мкг.
Массу образца помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 или 250 куб. см,

соединенную шлифом с обратным водяным холодильником, добавляют 40 - 60 куб. см этилового

спирта 0,1 - 0,2 г аскорбиновой кислоты и 50% раствор KOH. Доля добавляемого раствора KOH

зависит от вида продукта и от массовой доли и состава в нем жира. При анализе продукта с низкой

массовой долей жира (менее 6%) и витамина A (мясо, рыба и готовые блюда из них) на 10 г массы

образца добавляют 2 - 4 куб. мм раствора KOH. При более высокой массовой доли жира в этих

продуктах на 10 г образца добавляют 6 - 10 куб. см раствора KOH. Для продуктов с более высокой

массовой долей витамина A (яйцо, творог и готовые блюда из них) и жира > 10% на массу образца 5

- 7 г берут 5 - 7 куб. см щелочи. При анализе молока и молочных продуктов с низкой массовой долей

жира и витамина A массу навески увеличивают до 20 г, щелочь добавляют 5 - 7 куб. см. Для

продуктов с высокой массовой долей жира 30% и выше (сыры, масло сливочное и др.) на массу

образца 3 - 5 г берут 4 - 8 куб. см щелочи.


После добавления щелочи смесь нагревают на водяной бане с обратным водяным

холодильником при температуре кипения смеси в течение 30 мин. Затем смесь охлаждают и

переливают в делительную воронку. В воронку добавляют воду, чтобы окончательная концентрация

этилового спирта была около 30 - 35%. Признаком полного омыления служит то, что после

добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути увеличивают массовую долю

щелочи при омылении.


2. Экстрагирование. Неомыляемый остаток экстрагируют этиловым эфиром 4 раза, сначала

объемом эфира, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20% меньшими.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Ополаскивают эфиром колбу после омыления. Объединенный эфирный экстракт отмывают от

щелочи водой по фенолфталеину (при добавлении фенолфталеина промывная вода не должна

окрашиваться). Экстракт фильтруют через слой безводного сернокислого натрия в круглодонную

колбу роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно, чтобы над сернокислым

натрием не образовывался слой раствора, сернокислый натрий промывают эфиром. Затем эфир

отгоняют под вакуумом, и неомыляемый остаток растворяют в 5 куб. см гексана.


    3. Хроматография.  В суконный конец хроматографической колонки

помещают
капроновую  ткань, промытую  гексаном.  Затем непрерывной струей

насыпают в
колонку  окись  алюминия  с  массовой  долей  воды  3%  (см.

"Приготовление


реактивов"),   уплотняя  ее  легким  постукиванием  по  колонке 

стеклянной


палочкой.  На  верх  адсорбента  добавляют  слой безводного сульфата

натрия
(0,5 - 1,0 см).  Подготовленную  колонку  промывают  10 куб. см 

гексана  и
наносят   5 куб.  см   испытуемого  экстракта.   Затем   снова  

пропускают


10 куб. см  гексана  (фракция 1).  При  анализе  продуктов,  не 

содержащих


растительные продукты  (молочные,  мясные и  т.д.) после гексана

пропускают


через  колонку  раствор  ацетона в гексане с массовой  долей 4%, до

тех пор
пока  элюат не станет бесцветным  (фракция 2).  В этом случае фракцию

1 и 2
объединяют,  выпаривают  под  вакуумом  на  роторном  испарителе,  

остаток
растворяют в гексане  (5 - 10 куб. см) и в растворе определяют бета-

каротин
(V ).
  1
    При  анализе  образца,  содержащего  продукты животного и

растительного


происхождения, после  гексана  через  колонку  пропускают раствор

ацетона в


гексане  с  массовой  концентрацией  10%  (30  куб. см). Витамин A

элюируют
последующим  пропусканием  через  колонку  30  куб.  см  раствора


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
ацетона в
гексане  с массовой концентрацией 15% (фракция 3). Пропускают раствор

через
колонку  при  небольшом  разрешении  (2,5  - 3,0 куб. см/ мин.).

Фракцию 3,
содержащую  витамин  A,  выпаривают  в  роторном  испарителе под

вакуумом и


растворяют остаток в хлороформе (2 - 6 куб. см) (V ).
                                                  2
4. Определение витамина A.
1) Проведение определения. Вносят 0,4 куб. см хлороформного раствора витамина A в кювету,

помещают ее в кюветодержатель фотоэлектроколориметра, добавляют 4 куб. см раствора

треххлористой сурьмы и быстро измеряют оптическую плотность, так как окраска неустойчива и

начинает исчезать через 5 - 6 сек. Измерение проводят при длине волны 620 нм. После измерения

наблюдают за окраской раствора: синяя окраска должна исчезнуть и после этого раствор не должен

быть окрашенным или мутным. Помутнение возможно в случае попадания воды с испытуемым

раствором или с раствором сурьмы. Наличие окраски раствора через 15 с после проведения реакции

свидетельствует о недостаточно полном отделении витамина A от мешающих соединений. В том и

другом случае анализ необходимо повторить, учтя вышеуказанные замечания.
2) Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора ретинола ацетата с массовой

концентрацией 58 МЕ/ куб. см готовят разведения с массовой концентрацией 1,2 МЕ/ куб. см (1 куб.

см стандартного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят объем до

метки хлороформом); 2,9 МЕ/ куб. см (0,5 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную

пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см); 5,8 МЕ/ куб. см (1 куб. см

стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем

хлороформом до 10 куб. см); 11,6 МЕ/куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в

градуированную пробирку на 5 куб. см и доводят объем хлороформом до 5 куб. см). Приготовленные

растворы хорошо перемешивают. Из каждого разведения отбирают по 0,4 куб. см раствора и проводят

колориметрическую реакцию так же, как при анализе испытуемых растворов. Для построения

калибровочного графика по оси ординат откладывают полученные значения оптической плотности, а

по оси абсцисс - соответствующие им количества витамина A в 1 куб. см раствора в МЕ.


    3) Расчет. Массовую долю витамина A в мг на 100 г продукта

вычисляют по


формуле:
                                 K x V  x 100
                                      2
                             X = ------------

,                          (1)


                                   3300 x a
    где:
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
    K - массовая концентрация витамина A в 1 куб. см  испытуемого

раствора,


определяемая по стандартной кривой, МЕ;
    V  - общий объем раствора в хлороформе, куб. см;
     2
    100 - пересчет на 100 г продукта;
    3300 - пересчет на МЕ в мг;
    a - масса образца, г.
Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают

среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между параллельными

определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического значения.
5. Определение бета-каротина.
1) Экстрагирование каротина из растительного материала (свежие и сухие овощи, плоды,

ягоды).
Интервал определяемых концентраций бета-каротина составляет 0,1 - 1 мкг/ куб. см раствора,

оптическую плотность которого измеряют на спектрофотометре. Массу навески продукта (1 - 15 г с

массовым содержанием бета-каротина 0,01 - 0,05 мг) и последующее разведение рассчитывают

исходя из интервала указанных концентраций.
    Массу  исследуемого образца, взятую из средней пробы переносят в

ступку
или  стакан  смесителя,  добавляют  0,1  -  0,2  г  аскорбиновой 

кислоты и
растирают с небольшим количеством измельченного стекла или

гомогенизируют в


смеси ацетон-гексан (1:1). Затем смеси дают отстояться и сливают

прозрачный


экстракт  в  делительную  воронку.  Экстракцию  повторяют  до тех

пор, пока


раствор  не  станет бесцветным. Отмывают объединенный экстракт от

ацетона 3


раза порциями воды, равными объему ацетона, использованного при

экстракции.


Экстракт фильтруют через слой сернокислого безводного натрия в

круглодонную


колбу  от  роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см

медленно и


промывают  слой  сернокислого  натрия на фильтре 2 раза небольшими

порциями
гексана.  Выпаривают гексан на роторном испарителе до объема 4 - 5


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
куб. см,
если  раствор  интенсивно  окрашен,  его  не  выпаривают  и  измеряют

объем
раствора (V ).


           3
    2) Хроматография  бета-каротина  при  анализе  растительного 

сырья.  В


хроматографическую  колонку  непрерывной  струей  насыпают окись

алюминия с


массовой  долей  воды  1%,  уплотняя  ее  легким  постукиванием  по

колонке
стеклянной   палочкой.   На   верх  адсорбента  добавляют  слой 

безводного
сернокислого  натрия  высотой  0,5  -  1,0 см. Колонку промывают 10

куб. см
гексана  и  наносят 5 куб. см раствора бета-каротина в гексане,

полученного
(раздел 2) при  анализе  продуктов  из  животного и растительного

сырья или


раздел 5.1 (в дальнейшем необходимо следить, чтобы верхний слой

колонки был


всегда  покрыт  раствором).  Каротиноиды на высоте  колонки  (сверху 

вниз)
располагаются  в  следующем  порядке:  хлорофилл,  ксантофиллы, 

ликопин  и
каротины (бета  и  альфа).  Альфа-  и  бета-каротины  из  всех

каротиноидов


обладают  на  окиси  алюминия  наименьшей  адсорбционной 

способностью и их


элюируют, пропуская  10 куб. см гексана или пропуская после гексана

раствор
ацетата в гексане с массовой концентрацией 1% до тех пор, пока

вытекающий с
колонки  раствор  не  станет  бесцветным.  После  элюции каротина с

колонки
измеряют объем элюата (V ).
                        1
    3)   Спектрофотометрическое   определение  бета-каротина  и 

расчет  на


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
спектрофотометре  определяют оптическую плотность растворов бета-

каротина в


гексане,  полученных в разделах 3 и 5.2, при  длине волны  450  -  45

нм  и
                                                                    

1%
рассчитывают содержание, используя коэффициент удельного поглощения

E    .
                                                                    

1 см
    Массовую  долю   бета-каротина  в  мг  на  100 г  продукта

вычисляют по


формуле:
                              10 x Д x V  x 100
                                        1
                          X = -----------------

,                        (2)


                                  1%
                                 E     x a
                                  1 см
    где:
    10 - содержание каротина в 1 куб. см 1% раствора, мг;
    Д - оптическая плотность испытуемого раствора, куб. см;
    V  - объем элюата, куб. см;
     1
    100 - пересчет на 100 г продукта;
     1%
    E     = 2580;
     1 см
    a - навеска, г.
    При анализе растительного материала массовую долю бета-каротина в

мг на
100 г продукта вычисляют по формуле:


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
                          10 x Д x V  x V  x 100
                                    1    3
                      X = ----------------------

,                       (3)


                               1%
                              E     x 5 x a
                               1 см
    где:
    V  - общий объем испытуемого раствора, куб. см;
     3
    5 - объем раствора, нанесенный на колонку, куб. см;
остальные обозначения, что и к формуле (2).
Полноту отделения бета-каротина от ликопина проверяют путем снятия спектра при длинах

волн 420 - 430 нм с интервалами 5 нм. Если полученные максимумы соответствуют максимуму

поглощения для бета-каротина в гексане (450 - 451, 475 нм), то, следовательно, бета-каротин отделен

от ликопина.


Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают

среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными



определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Каталог: law -> hozjajstvennaja-dejatelnost -> promyshlennost
promyshlennost -> Бобков ю. Г., Бабаян э. А., Машковский м. Д., Обоймакова а. Н., Булаев в. М., Гуськова л. С., Лепахин в. К., Любимов б. И., Натрадзе а. Г
promyshlennost -> Производство инфузий в россии: опасная "игра" по разным
promyshlennost -> Локализация и механизмы действия лекарственных веществ. "Мишени" для лекарственных веществ
promyshlennost -> Растительное сырье редакционная коллегия государственной фармакопеи СССР
promyshlennost -> Экспериментальное животное: основы правового регулирования
promyshlennost -> Методические рекомендации оценка аллергизирующих свойств фармакологических средств n 98/300


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница