Использование экспресс-теста для диагностики дуоденальной гиполактазии по биоптату при проведении эндоскопического исследования Проблема и изучаемые



Дата28.04.2016
Размер421 Kb.










Использование экспресс-теста для диагностики дуоденальной гиполактазии по биоптату при проведении эндоскопического исследования
Проблема и изучаемые цели: Изучались возможности использования нового экспресс-теста для диагностики лактазной недостаточности у взрослых при проведении эндоскопического исследования. При проведении этого теста биоптат из постбульбарной части двенадцатиперстной кишки (12пк) инкубируют с лактозой в тестовом планшете, цветовая реакция развивается в течение 20 минут как результат гидролиза лактозы. При изменении окраски регистрируется положительный результат (у пациента нормолактазия), если окрашивание не развивается - результат отрицательный (у пациента тяжелая гиполактазия).
Пациенты и методы: было исследовано по два биоптата из постбульбарной части 12пк, взятых у 80 амбулаторных пациентов с явлениями диспепсии. Биоптаты были использованы для проведения экспресс-теста на лактазную недостаточность («Biohit PCL», Helsinki, Finland) и для биохимического определения дисахаридаз (лактазы, сахаразы и мальтазы). Дополнительно определялся генотип С/Т_13910 путем выделения ДНК из биоптата слизистой, полученного из антрального отдела желудка (метод ПЦР).
Результаты: У 21 пациента из 22 (95%; 95% CI, 87-100%) с биохимической активностью лактазы < 10 Ед/г протеин был отмечен отрицательный результат при использовании экспресс-теста на лактазную недостаточность (Biohit), но ни у одного из 58 пациентов с лактазной активностью 10 Ед/г протеина и более отрицательный результат не зафиксирован. У 7 пациентов из 80 (9%; 95% CI,3-15%) экспресс-тест показал легкую тяжесть лактазной недостаточности (слабая цветная реакция). У всех пациентов с целиакией (n=6) результат экспресс-теста был отрицательным. У 9 из 74 пациентов (шесть пациентов с целиакией были исключены) определен СС_13910 генотип при генетическом исследовании, что указывает на лактазную недостаточность. Все они имели отрицательный результат по экспресс-тесту на лактазную недостаточность. 26 пациентов имели ТТ генотип, что определяется как нормолактазия, ни у кого из этих пациентов не отмечен отрицательный результат при использовании экспресс-теста. Шесть из 39 пациентов (15%; 95% CI, 4-27%) с CT генотипом имели отрицательный результат при использовании экспресс-теста.

Выводы: Экспресс-тест позволяет эффективно идентифицировать пациентов с тяжелой лактазной недостаточности. При сравнении СС-пациентов (лактазная недостаточность) с ТТ-пациентами (нормолактазия) чувствительность и специфичноть была 100%. В сравнение с биохимическими тестами чувствительность и специфичность экспресс-теста при отрицательных результатах экспресс-теста (активность лактазы < 10 Ед/г протеин) составили 95% (95% CI, 87-100%) и 100% соответственно.
Введение
Активность лактазы слизистой кишечника с возрастом начинает снижаться, что приводит к развитию лактазной недостаточности или лактазной непереносимости. После употребления молочных продуктов появляются такие клинические симптомы, как боль в животе, вздутие, спазмы, метеоризм, тошнота и диарея вследствие отсутствия гидролиза лактозы в кишечнике [1]. Гиполактазия у взрослых людей - нормальное физиологическое состояние после прекращения грудного вскармливания [1]. Однако приблизительно у половины мировой популяции активность лактазы сохраняется и в зрелом возрасте, эта часть популяции способна усваивать лактозу в течение всей жизни (переносимость лактозы, «нормолактазия»). Переносимость лактозы наследуется по доминантному типу, это часто встречается в популяциях, в культуре которых сформировалось употребление молочных продуктов, особенно в Северной Европе [3-5]. Ген С/Т_13910 локализуется около 14kb от инициирующего кодона лактазы в хромосоме 2q21, и связан с переносимостью/непереносимостью лактозы [6-9].
Диагноз лактазной недостаточности обычно ставится на основании теста на переносимость лактозы, специфичность и чувствительность которого составляют 77-96% и 76-94%, соответственно [10]. Специфичность дыхательного водородного теста составляет 89-100%, чувствительность 69-100% [10]. Прямые биохимические методы оценки дисахаридазной активности в биоптате слизистой тонкого кишечника продолжают быть классическими референтными тестами [11]. Большинство современных тестов позволяют определить генотип С/Т_13910 в лимфоцитах крови [6].
Среди пациентов, пришедших на эндоскопию верхних отделов ЖКТ, есть пациенты с абдоминальными симптомами, которые вызваны гиполактазией и непереносимостью молочных продуктов. В последнее время был разработан новый метод для быстрой диагностики дуоденальной гиполактазии при эндоскопическом исследовании. Это метод основан на инкубации с лактозой биоптата, полученного при эндоскопии из постбульбарной части 12пк. При инкубации в планшете в течение 20 минут развивается выраженная цветовая реакция, если лактазная активность в норме, что связано с высвобождением глюкозы в результате гидролиза лактозы.
Исследование демонстрирует возможность применения нового экспресс-теста для диагностики лактазной недостаточности в сравнении с биохимическими тестами оценки активности лактазы по дуоденальным биоптатам, и тестами, выявляющими ген С/Т_13910.
Пациенты и методы
Пациенты

Была отобрана группа из 80 амбулаторных пациентов (возраст 47±16; 30 мужчин, 50 женщин), которым выполнили диагностическую эндоскопию верхнего отдела ЖКТ по поводу диспептических симптомов (Центральный госпиталь университета Хельсинки/Госпиталь Йорви, 2003г.). Дополнительно к рутинной биопсии для микроскопии (постбульбарная и луковичная часть 12пк, антрум и тело желудка) были взяты два биоптата из постбульбарной части 12пк. Один биоптат использовался для постановки экспресс-теста, второй для проведения биохимического анализа дисахаридазной активности [11].


Регистрация симптомов

До эндоскопии всех пациентов спрашивали о переносимости ими молочных продуктов. Те пациенты, которые не употребляли молочные продукты или у них были симптомы, связанные с их употреблением, а также пациенты, у которых в истории болезни были сведения о положительном тесте на лактазную недостаточности, рассматривались как пациенты с положительной симптоматикой (1 степень непереносимости молочных продуктов). Тех, кто употреблял в пищу молочные продукты, и пациентов, не имевших симптомов, отнесли в группу с 0 степенью (переносимость молочных продуктов).


Реагенты

Были использованы следующие реагенты: пероксидаза, гексокиназа, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа, аденозинтрифосфат (АТФ) производства Roshe Diagnostics, Mannheim, Германия. Глюкозоксидаза производства Fluka BioChemica, Buchs, Швейцария, и лактоза производства Merck. Darmstadt, Германия. НАДФ, мальтоза, сахароза и TMB2YCl (3.3`5.5`- тетраметилбензидин дигидрохлорид) производства Sigma-Aldrich Chemie, Steinhem, Германия.


Приготовление гомогенизированного образца
Биоптаты хранились при температуре -70°С и взвешивались в холодной комнате при температуре -20ºС. Использовались стеклянные гомогенизаторы, гомогенизация производилась в дробленом льду во избежание перегрева образца. Каждый биоптат был гомогенизирован в 200 мл физиологического раствора.
Измерение дисахаридазной активности
Измерение дисахаридазы проводилось на водяной бане при температуре 37ºС в тонкостенных пробирках для полимеразой цепной реакции в соответствии с методом рекомендованным Dahlqvist [11]. Дисахаридазная реакция начиналась после добавления в субстрат буферного раствора (лактоза, сахароза и мальтоза в 0,1-mol/l щелочно-малатного буфера, рН 6,0) до концентрации 0,26 mol/l. Добавлением воды вместо раствора субстрата готовили образец бланка. Общее время реакции составляло 60 минут, при температуре 37ºС. После этого реакция останавливалась помещением пробирок в лед и добавлением соляной кислоты при конечной концентрации 0,43 mol/l и перемешивали. Образцы нейтрализовались 0,43 mol/l КОН - 0,075 моль/л основанием имидазола - 0,075 mol/l КСl. Сформировавшийся при нейтрализации преципитат центрифугировали, удаляли всплывшую глюкозу и измеряли ее концентрацию на флуориметре «Transcon 102 FN» («Biohit PCL», Helsinki, Finland), использовалась гексокиназа/глюкоза-6-фосфат в реакции дегидрогенизации с НАДФ в качестве кофактора [12]. Образцы разводились в 40 раз от первоначального объема в растворе буфера, содержащего 0,14 Ед/мл глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, 0,1 mmol/l НАДФ, 0,5 mmol/l дитиотрейтол (DТТ), 0,3 mmol/l АТФ, 1 mmol/l ЭДТА, 5 mmol/l MgCl2 и 50 mmol/l Трис- HCl буфера с рН 8,1. Бланк-буфер был измерен в реакции с добавлением гексокиназы (в 20 mmol/l Трис-HCl буфере, рН 8,1) до конечной концентрацией 0,35 Ед/мл. Биохимическая активность кишечной лактазы хорошо коррелировала с соотношением лактаза-сахараза (L/S коэффициент) (рисунок 1). Чем ниже была активности лактазы, тем меньше был L/S коэффициент. У всех шести пациентов с диагнозом целиакия активность лактазы составляла < 10 Ед/г протеин, был низким L/S коэффициент (< 0,25).
Рисунок 1. Оценка биохимической активности лактазы и L/S коэффициента при исследовании биоптатов из постбульбарной части 12пк (80 человек). Пациенты с лактазной активностью < 10 Ед/г протеин и L/S коэффициент < 0,25 обозначены точечными линиями.

Определение протеина

Концентрация протеина в гомогенизированных образцах определялась с помощью теста «BioRad Dc Protein A» с BSA в качестве стандарта (BioRad Laboratories, Hercules, California, USA) в соответствии с инструкцией производителя.


Расчет результатов и статистика

Результат выражался в Ед (Ед=Мкмоль субстрата/мин при температуре 37ºС дисахаридазы)/г протеин. В статистическом анализе использовались оба параметрических теста (t-тест Стьюдента после логарифмической трансформации, при необходимости) и непараметрический тест (chi-квадрат). Дополнительно подсчитывался 95% доверительный интервал (95% СI).


Оценка лактазной активности в биоптате с использованием экспресс-теста

Экспресс-тест для диагностики лактазной недостаточности («Biohit PCL», Helsinki, Finland) использовался для оценки лактазной активности при эндоскопическом обследовании. Набор состоит из планшета для образца и бутылочек с растворами реагентов. Тест проводился согласно инструкции производителя. Образец помещали в лунку планшета и добавляли растворы реагентов в указанном объеме и через определенное время. Реакция происходит в два этапа, при комнатной температуре: 15-минутная лактазная реакция, за которой сразу, через 5 минут, следует сигнальная реакция, в процессе которой высвобожденная глюкоза измеряется глюкозо-оксидазно/пероксидазной реакцией.


Для надлежащей оценки результатов экспресс-теста была создана цветная визуально-аналоговая шкала, калиброванная с помощью одновременного биохимического определения активности фермента в образцах из аналогичных мест постбульбарной части 12пк у одних и тех же пациентов. Отсутствие цветовой реакции соответствует активности лактазы менее 10 Ед/г протеин (тяжелая гиполактазия); светло-голубое окрашивание соответствует 10-30 Ед/г протеин (средняя степень гиполактазии); и темно-голубое окрашивание соответствует 30 Ед/г протеин и более (нормолактазия).
Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), ПЦР, прямое соответствие

С/Т_13910 генотип определяли в прямой реакции. ДНК выделяли из парафиновых блоков (биоптаты слизистой антрального отдела желудка), использовался ДНК набор (Puregene, Gentra Sistem, Minneapolis, Minnesota, USA), описанный ранее [7].


Этические аспекты исследования

Исследование было одобрено этическим комитетом Окружного госпиталя университета Хельсинки, Финляндия. Цель исследования объясняли всем пациентам перед проведением эндоскопическим обследованием, все пациенты давали письменное согласие на участие в данном исследовании.


Результаты
Гистограмма биохимической активности лактазы в дуоденальных биоптатах 80 пациентов изучаемой группы представлена на Рисунке 2. На гистограмме представлены две, а возможно и 3 различные подгруппы: с лактазной активностью менее10 Ед/г протеин и с лактазной активностью 10 Ед/г протеин и более. В первой подгруппе 19 из 22 пациентов (86%; 95% CI, 72-100%) не употребляли молочные продукты или у них наблюдались симптомы, связанные с употреблением молока чаще, чем в группе пациентов с активностью лактазы 10 Ед/г протеин и более (19 из 58 пациентов 33%, 95% CI, 21-45%; Р<0,001).
Рисунок 2. На гистограмме представлена биохимическая активность лактазы во всей изучаемой группе. Распространенность симптомов, вызванных употреблением молочных продуктов, показана на трех отдельных подгруппах.

Биохимическая активность лактазы и экспресс-тест на лактазную недостаточность.

У 22 пациентов из 80 активностью лактазы была на уровне < 10 Ед/г протеин, у всех пациентов этой группы L/S коэффициент был < 0,25 (см. рис. 1). Из них у 21 пациента (95%; 95% CI, 87-100%) получен отрицательный результат экспресс-теста на лактазную недостаточность (тяжелая гиполактазия). Ни у одного из 58 пациентов с лактазной активностью 10 Ед/г протеин или более не зафиксирован отрицательный результат экспресс-теста. Однако у семи из 80 пациентов (9%; 95% CI, 3-15%) результаты экспресс-теста были слабоположительными (гиполактазия средней тяжести). У этих пациентов значение и среднее значение биохимической активности лактазы находились на границы между двумя группами: с отрицательным результатом теста (тяжелая степень лактазной недостаточности) и с положительным результатом теста («нормолактазия») (рисунок 3).


Рисунок 3. На диаграмме представлена взаимосвязь между результатами экспресс-теста и биохимической активностью кишечной лактазы. Прямоугольники представляют средние значения 50 % случаев. Вертикальные линии показывают среднее значение. Линия из точек соответствует уровню активности кишечной лактазы в 10 Ед/г протеин и используется в качестве значения cut-off по наличию симптомов, связанных с употреблением молочных продуктов (см. рисунок 2).

У шести пациентов с диагнозом целиакии при микроскопии наблюдалась атрофия дуоденальных ворсин. У всех пациентов этой группы лактазную активность была < 10 Ед/г протеин и L/S коэффициент < 0,25. Результат экспресс-теста у этой группы был отрицательным (тяжелая гиполактазия) (рисунок 1).
С/Т_13910 полиморфизм и экспресс-тест

Данные, полученные при сравнении экспресс-теста и С/Т_13910 полиморфизма, представлены в Таблице 1. Шесть пациентов с диагнозом целиакия были исключены из анализа. Все 9 пациентов с С/С_13910 генотипом (ген, свидетельствующий о пониженной активности лактазы) имели отрицательный результат, но ни у кого из 26 пациентов с Т/Т_13910 генотипом (определяет высокую лактазную активность у взрослых) не был отмечен отрицательный результат экспресс-теста. У шести из 39 пациентов (15%, 95% CI, 4-27%) с С/Т_13910 генотипом отмечался отрицательный результат экспресс-теста (тяжелая гиполактазия). У всех этих пациентов биохимическую активность лактазы была менее 10 Ед/г протеин, L/S коэффициент < 0,25.





В нескольких словах

Экспресс-тест Biohit предназначен для экспресс диагностики лактазной недостаточности по биоптату из постбульбарной части 12пк во время проведения эндоскопического исследования. Тест показал высокую достоверность в сравнении с биохимическим определением активности лактазы и С/Т_13910 полиморфизмом, который ассоциируется с лактазной недостаточностью у взрослых.

Таблица 1. Взаимосвязь экспресс-теста и С/Т_13910 полиморфизма (шесть пациентов с диагнозом целиакия не учитывались). Есть существенное различие в количестве пациентов с гиполактазией и нормолактазией (Р<0,001; таблица сопряженности признаков для chi-квадрат теста) в группах с разным генотипом.




Генотип

Экспресс-тест Biohit

Всего

Гиполактазия

Тяжелая

Средней тяжести

Норма

CC

9

0

0

9

CT

6

5

28

39

TT

0

2

24

26

Итого

15

7

52

74



Обсуждение результатов
Полученные данные показывают, что экспресс–тест на лактазную недостаточность по биоптату позволяет хорошо дифференцировать тяжелую гиполактазию и нормальную активность лактазы. Чувствительность и специфичность экспресс-теста при диагностике тяжелой лактазной недостаточности (лактазная активность < 10 Ед/г протеин) составили 95% (95% CI, 87-100%) и 100%, соответственно, в сравнении с биохимическим определением активности лактазы в 12пк. Результаты, полученные с помощью экспресс–теста, сравнили с результатами генетических исследований (определение С/Т_13910 полиморфизма), чувствительность и специфичность экспресс–теста для диагностики лактазной недостаточности составила 100%. У 9 пациентов с С/С_13910 генотипом (свидетельствует о гиполактазии у взрослых) был отрицательный результат теста, но ни одного из 26 пациентов с Т/Т_13910 генотипом (свидетельствует о нормолактазии) отрицательный результат при использовании экспресс–теста не получен. Кроме того, все 6 пациентов с целиакией имели тяжелую лактазную недостаточность (активность лактазы менее 10 Ед/г протеин и L/S коэффициент < 0,25), у всех пациентов этой группы был отрицательный результат экспресс-теста.
В изучаемой группе было семь пациентов (9%), у которых результат экспресс–теста был слабоположительным (гиполактазии средней тяжести). У этих пациентов значение и среднее значение биохимической активности лактазы были средними по сравнению с четко положительными или четко отрицательными результатами. Эти пациенты были гетерозиготны по С/Т_13910 полиморфизму. Это предполагает, что у гетерозиготных по аллелю С/Т_13910 людей на половину снижена способность к усвоению лактозы по сравнению с С/С_13910 гомозиготными. В представленной группе появление симптомов после употребления молочных продуктов связано с тяжелой степенью гиполактазии - активность дуоденальной лактазы менее 10 Ед/г протеин (значение cut-off часто используемое как показатель тяжелой гиполактазии с выраженной клинической картиной) [13].
Заключение. Проведенное исследование показало, что отрицательный результат экспресс-теста с высокой степенью достоверности позволяет диагностировать тяжелую лактазную недостаточность, положительный результат указывает на нормолактазию с высокой чувствительностью и специфичностью. Тест удобен в применении, его использование и стоимость аналогичны быстрым уреазным тестам, которые обычно используются для эндоскопической диагностики Helicobacter pylori в биоптате желудка.

Рисунок 1. Оценка биохимической активности лактазы и L/S коэффициента при исследовании биоптатов из постбульбарной части 12пк (80 человек). Пациенты с лактазной активностью < 10 Ед/г протеин и L/S коэффициент < 0,25 обозначены точечными линиями.

Надписи на рисунке:
Lactase/Sucrase ratio = соотношение лактаза/сахараза
Lactase U/g protein = Лактаза, Ед/г протеин
Celiac disease = Целиакия
No celiac disease = Целиакии нет


Рисунок 2. На гистограмме представлена биохимическая активность лактазы во всей изучаемой группе. Распространенность симптомов, вызванных употреблением молочных продуктов, показана на трех отдельных подгруппах.

Надписи на рисунке:


Symptoms = Симптомы
Count = Кол-во
Duodenal lactase U/g protein = Активность дуоденальной лактазы, Ед/г протеин

Рисунок 3. На диаграмме представлена взаимосвязь между результатами экспресс-теста и биохимической активностью кишечной лактазы. Прямоугольники представляют средние значения 50 % случаев. Вертикальные линии показывают среднее значение. Линия из точек соответствует уровню активности кишечной лактазы в 10 Ед/г протеин и используется в качестве значения cut-off по наличию симптомов, связанных с употреблением молочных продуктов(см. рисунок 2).



Надписи на рисунке:
Duodenal lactase U/g protein = Активность кишечной лактазы, Ед/г протеин
Quick Lactase test = Экспресс-тест
Severe hypolactasia = Тяжелая гиполактазия
Mild hypolactasia = Гиполактазия средней тяжести
Normolactasia = Норма

Таблица 1. Взаимосвязь экспресс-теста и С/Т_13910 полиморфизма (шесть пациентов с диагнозом целиакия не учитывались). Есть существенное различие в количестве пациентов с гиполактазией и нормолактазией (Р<0,001; таблица сопряженности признаков для chi-квадрат теста) в группах с разным генотипом.


Генотип

Экспресс-тест Biohit

Всего

Гиполактазия

Тяжелая

Средней тяжести

Норма

CC

9

0

0

9

CT

6

5

28

39

TT

0

2

24

26

Итого

15

7

52

74






Каталог: 464996


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница