Курс “Биохимия”



страница1/4
Дата14.01.2019
Размер60.5 Kb.
ТипЛекция
  1   2   3   4


Лекция 10.
Генная инженерия

Технология создания и использования рекомбинантных ДНК

Детальное изучение механизма рекомбинации позволило осуществить в лабораторных условиях синтез новых молекул ДНК, в которых гены одного организма оказываются объединенными с генами другого. Такой синтез явился величайшим достижением молекулярной биологии, при­ведшим к возникновению нового научного направления — генной инже­нерии. Генная инженерия дала возможность получать новые искусствен­ные комбинации генов, не встречающиеся в природе.

Большой прогресс был сделан после открытия сайт специфическнх эндонуклеаз, названных в дальнейшем эндонуклеазами рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции имеют две характерные особенности: они способны узнавать лишь участки достаточно протяженной нуклеотидной последовательности; они катализируют процесс образования сме­щенных относительно друг друга разрывов в обеих цепях молекулы ДНК (разрывы наискосок). Эта уникальная особенность эндонуклеаз рестрикции позволила получить фрагменты ДНК с одноцепочечными липкими концами и переносить их из одного организма в другой. Так, Е. соli продуцирует эндонуклеазу рестрикции (ЕсоШ), действующую на последовательность ...СААТТС... и расщепляющую связь между О и А. В составе дуплекса ДНК эта последовательность комплементарна последовательности .... СТТААО ...., другой цепи и в то же время при прочтении ее справа налево она идентична последовательности нуклео-тидов первой цепи. Такой участок молекулы ДНК называется палиндро­мом (так называют выражения, читающиеся одинаково в обоих направ­лениях, например: "А роза упала на лапу Азора").

В результате действия фермента ЕсоШ на вновь образованных фраг­ментах ДНК возникают липкие концы. Один из фрагментов имеет на конце одноцепочечный участок, комплементарный одноцепочечному участку на другом фрагменте. Возникает возможность взаимного уз­навания и реконструирования таких фрагментов благодаря взаимо­действию комплементарных оснований.

Для переноса в клетку-хозяина фрагмента чужеродной ДНК необ­ходима другая ДНК, способная объединиться с этим фрагментом и осуществить его перенос. Эта ДНК получила название вектора. Функ­цию вектора способны выполнить ДНК-плазмиды и ДНК-вирусы. Плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой интактные коль­цевые ДНК, отделенные от основной хромосомы бактерии. Плазмида гораздо мельче хромосомы, в клетке может находиться до десятка ее копий. Каждая плазмида содержит несколько, а иногда много генов, которые реплицируются, транскрибируются и транслируются незави­симо от хромосомных генов, но одновременно с ними. Бактерии могут существовать и без плазмид, однако, их присутствие сообщает клетке специфические свойства. Так, многие плазмиды содержат гены, коди­рующие синтез ферментов, способных разлагать антибиотики и обес­печить устойчивость бактериальной клетки к ним. Такие плазмиды важны как маркеры при скрининге (отборе) трансформированных клеток, образовавшихся в процессе эксперимента по получению рекомбинантных ДНК.

В качестве вирусного вектора заслуживает внимания ДНК фага X. Она легко переносит чужеродный ген в Е. соli. Если ДНК фага X, несу­щую чужеродный ген, смешать с белком оболочки этого фага, то обра­зуются фаговые частицы, весьма эффективно инфицирующие клетку-хозяина.

Технология создания и использования рекомбинантных ДНК вклю­чает следующие основные этапы:



  1. получение целевого гена;

  2. соединение этого гена с вектором (получение рекомбинантной ДНК);

  3. введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина;

4) отбор клеток, содержащих целевой ген; клонирование гена.
Получение целевого гена основано на использовании фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы), осуществля­ющей синтез ДНК с использованием в качестве матрицы РНК. Клет­ки, интенсивно синтезирующие целевой ген и его мРНК, лизируют: освободившиеся полирибосомы (полисомы) собирают центрифугиро­ванием и их обрабатывают антигенами против того белка, ген которо­го необходимо выделить. Полирибосомы вместе с синтезированным ими белком дают нерастворимый комплекс с антигеном, откуда выде­ляют мРНК. Ее используют в качестве матрицы для синтеза гена с помощью обратной транскриптазы.



Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница