Курс “Биохимия”


Соединение гена с вектором (получение рекомбинантной ДНК



страница2/4
Дата14.01.2019
Размер60.5 Kb.
ТипЛекция
1   2   3   4
Соединение гена с вектором (получение рекомбинантной ДНК

Существуют два варианта встраивания гена в вектор:

1) встраивание, когда оба компонента имеют липкие концы;

2) встраивание компоненты несут тупые (некомплементарные) концы.

По первому варианту, получившему название "шотган" (от англ 8Но^§ип — дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции, образующей в месте разрыва одноцепочечные липкие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды. переведенные в линейную форму той же самой эндонуклеазой рест­рикции. В результате образуется сложная смесь гибридов фрагмент - ДНК-плазмида. Для поиска гибрида, несущего целевой ген, использу­ют процедуры скрининга. Как видим, этот метод объединяет два эта­па — выделение целевого гена и его встраивание в вектор.

По второму варианту ДНК необходимо снабдить липкими концами. С этой целью к З'-концам ее цепей присоединяют дезоксирибонуклеотис.-ные остатки одного типа, например, остатки аденозина. Синтез липког-: конца идет в присутствии АТР с помощью специфической трансферазы Эта трансфераза обладает групповой специфичностью к дезоксирибонук-леотидам, не нуждается в матрице; на обоих концах ДНК она катализи­рует синтез ро!у (А)-хвоста, состоящего из 50—100 остатков.

В свою очередь, плазмиду переводят в линейную форму, расщеп­ляя ее в одной точке рестрикционной эндонуклеазой с образовани­ем в месте расщепления тупых концов (некомплементарных хвос­там ДНК). К тупым концам линейной плазмиды присоединяют лип­кие ро!у (Т)-хвосты (комплементарные ро!у (А)-хвостам ДНК). После смешивания обоих компонентов встроенные липкие концы соединя­ются по комплементарным парам А-Т и их сшивают с помощью ДНК-лигазы, в результате чего образуется гибридная ДНК.

Введение гибридной ДНК в клетку-хозяина. Этот этап основан на том, что ДНК способна проникать в большинство эукариотических клеток. Однако эффективность этого проникновения весьма невелика (примерно 1—2 клетки из 106). Ее увеличивают, подбирая специаль­ные условия. Так, например, существенно возрастает проникновение ДНК в клетки Е. соli, если в среду ввести ионы Са2+.



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница