Микробиологический синтез витамина в12



Скачать 212.5 Kb.
Дата27.04.2016
Размер212.5 Kb.
Просмотров189
Скачиваний0
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12

О.В. Мосин


Витамин В12, или цианкобаламин, — важное биологическое соединение, активный гематопоэтический фактор млекопитающих и ростовой фактор для многих видов микроорганизмов и животных.

Начало истории витамина B12 положили исследования злокачественного малокровия (пернициозной анемии) — заболевания, поражающего в основном пожилых людей, но наблюдаемое иногда и у детей.

До 1926 г. это заболевание было неизлечимым и обычно кончалось смертью. При этом заболевании в организме вырабатываются аномально большие, недоразвитые и нестойкие эритроциты, общее количество которых значительно снижа­лось (1x106—3xЮ6 мм~3 вместо 4,5x106—6x106 мм~3). Заболевание поражает также и другие быстрорастущие ткани, например слизистую оболочку желудка (в результате прекращается секреция НСl) и нервные ткани. При этом часто наблюдается демиелинизация центральной нервной системы с нарушением координации движений (атаксия) и психотическими расстройствами. Внутримышечное введение 3-6 мкг витамина B12 достаточно, чтобы вызвать ремиссию у пациента, боль­ного перницитозной анемией.

В 1926 г. Мино и Морфи обнаружили, что с пернициозной анемией можно справиться, если употреблять в пищу сырую или слегка поджаренную печень из расчета 1/4 кг в день. И только 22 годами позднее из печени крупного рогатого скота были выделены первые красные кабальтсодержащие кристаллы витами­на B12. Позже выяснилось, что более богатым источником витамина могут служить жидкие ферментационные среды бактерий.

Структура витамина B12 была впервые определена в 1956 году Дороти Ходжкин методом дифракции рентге­новских лучей. Это была самая крупная органи­ческая молекула, структуру которой удалось определить мето­дами рентгено-структурного анализа. Циклическая система витамина B12 подобна циклической системе порфиринов (рис. 1); она состоит из четырех пиррольных колец с атомом кобальта в центре.

Нормальный уровень витамина B12 в крови составляет ~2-10~-10 M или немного выше, однако у вегетарианцев этот уровень может опускаться ниже половины этой величины. Недостаточность фолиевой кислоты также может вызывать, мегалобластическую анемию, а большой избыток фолиевои кислоты может в некоторой степени уменьшить анемию у па­циентов, больных злокачественным малокровием.

В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка —1 мг/кг), чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Активированный ил сточных вод содержит 4—10 мкг/кг витамина, но при этом требуется разделение большого числа различных форм (аналогов).

Химический синтез витамина В12 очень сложен. Больше 10 лет потребовалось сотрудникам двух больших лабораторий — Вудворта и Эшенмозера для осуще­ствления химического синтеза витамина В12, включающего 70 стадий. Поэтому в настоящее время витамин В12 в промышленности получают исключительно биосинтетическим путем. Из 10 тонн ежегодно выпускаемого в мире витамина B12 3,5 т приходится на цианкобаламин (собственно ви­тамин B12), 2 т на гидроксокобаламин, 1т — на коэнзим В]2 и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы в указанных количествах используют в медицине. Остальное количество витамина используется для животноводства.

Витамин B12 применяют при лечении злокачест­венной анемии, цирроза печени, при нервных и психических рас­стройствах. Он широко используется в производстве кормов. В на­стоящее время большинство комбикормов для свиней и птиц обо­гащают витамином В12, особенно благоприятное действие на жи­вотных оказывает сочетание витамина B12 с малыми дозами ан­тибиотиков, в частности биомицина. Витамин В12 воздействует на кроветворную функцию и на обмен белков, принимает участие в регуляции оптимального содержания в организме животного метионина, валина, треонина, лейцина, изолейцина.

У птиц снижение содержания B12, в желтке яиц приводит к резкому падению выводимости потомству. При добавлении В12 в корма (10—15 мг/т) прирост поросят увеличивается на 10—15%, цыплят — до 20%, яйценоскость кур — со 180 до 208 яиц в год. При добавлении Bi2 к кормам можно заменить животный белок растительным. Отечественная микробиологическая промышленность выпускает витамин B12 двух марок: А—200 мг/кг, В — не менее 500 мг/кг препарата.

Люди получают витамин В12 с пищей и не могут усваивать витамин, выделяемый бактериями кишок. Животные получают витамин В12 с кормом и утилизируют витамин, образуемый кишечной микрофлорой.

Молекулярная структура. Витамин B12 - первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух поч­ти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со+3 связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура — азотистое основание — 5,6-диметилбен-зимидазол (5,6 ДМБ}. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой си­стемой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью.

Структура витамина В12 не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части: 1) корриновая структура ранее не бы­ла известна в органической химии (до открытия витамина В12 в 1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.

Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна - N-3—5,6 ДМБ и последняя — верхним лигандом (У), природа которого может варьировать. В коммерческом витамине В12 (цианкобаламине) лиганд -CN-группа (артефакт процесса выделения).

In vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная группа (Co-B12—I), метильная группа (метилкобаламии, СН3—B12-CoB—II) или оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-аным основанием.

Нижний лиганд (х) -5,6 ДМБ может быть заменен на аденин {псевдовитамин В12), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин (фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некото­рых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех вита­мин В12-подобных соединений только Со-В12—I и Со-В12—II (СНз—В12) активны на клеточном уровне и как кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил B12 используется в реакциях, в которых имеет место перестройка углерод-углеродных связей. Метил В12 вовлекается в реакциях переноса метильных групп, например в синтезе метионина из гомоцистеина (Воробьева, 1982).

Недавно открыты новые аналоги витамина В12: три из них получены при частичном синтезе (фтор-метилфосфито-Р-кобаламид, диметилфосфито-Р-кобаламин, Fe-кобаламин) и один фактор VA выделенный из активного ила.

По сравнению с CN-кобаламином у них были модифицированы либо верхний лиганд, либо центральный атом корринового кольца. Два фосфито-корриноида, содержащие Со-Р-связь, про­являют активность в микроорганизме Qchromonas malhamensis (реакция как у высших животных) для Е. coll 215 и животных. В отличие от них Fe-кобаламин и фактор VA проявляли очень низкую актив­ность. Первые два аналога связывались с внутренним фактором (ВФ) животных (белок, участвующий в транспорте витамина bis), Другие два — нет. Значит, биологическая активность корре­лирует со способностью связываться с ВФ.

Биосинтез. Путь биосинтеза витамина В12 включает три ступени образования:

1) порфиринового ядра;

2) корринового ядра;

3) кобаламинов.

Путь до уропорфирина III хорошо изучен в отличие от последующих ступеней от УПГ III к кобириновой кислоте.

В последние годы открыт ряд пигментированных интермедиатов — метилкорриноидов. Источником СНз-групп слу­жит S-аденозилметионин. Диметилкоррифирин идентичен сирогидрохлорину (сирогему микробной сульфитредуктазы), следователь­но, этот интермедиат и возможно другие коррифирины имеют витаминнезависимую биологическую функцию.

Образование кобаламина включает: амидирование семи карбоксильных групп корринового кольца, включение остатка изопропиламина (происходит из треонина), активацию кобипамида с участием GTP и с образованием GMP, включение нуклеотидного основания.

Включение атома кобальта в систему происходит вскоре после об­разования кобириновой кислоты. У бактерии Prop. shermanii все извест­ные корриноиды, амидированные больше, чем кобириновая кис­лота, находятся в 5'-аденозильной форме. Аэробные и аэротолерантные формы синтезируют 5,6 ДМБ из рибофлавина через FMN. Для синтеза требуется кислород.

Анаэробы образуют 5,6 ДМБ другим путем, включающим глицин и метионин. 6-Аминолевулиновая кислота (6-АЛК) у аэро­бов образуется из глицина и сукцинил-СоА, а у анаэробов -из глутамата (как у растений).

Биосинтез витамина В12 у бактерий происходит двумя независимыми путями, но оба приводят к образованию 5'-дезоксиаде-нозилкобинамидгуанозипдифосфата и а-рибазол-5'-фосфата, яв­ляющихся субстратами для конечной стадии синтеза.

Из клеток мутанта Е. coli выделили 70S рибосомы, способные синтезировать витамин B12 в реакционной системе. Основным катализатором синтеза является белок 18L. Белки 5S RNA также катализирова­ли синтез витамина. Витамин В12, синтезированный при участии изолированных рибосом, был биологически активным.

Гем ока­зывает ингибирующее действие на общие начальные пути синте­за корриноидов и порфиринов. Синтез витамина В12 регулирует­ся на уровне монометилкоррифирина. Регуляция осуществляется с участием кобаламинов и аналогов, в которых 5,6 ДМБ заме­щен на аденин или метиладенин. Фактор В регулирующей актив­ностью не обладает. На биосинтез витамина В12 пропионовыми бак­териями стимулирующее действие оказывает ион NH4+; в его от­сутствии клетки витамин не синтезируют. Глутамин и аспарагин могут заменить ион NH4+. Стимулятором синтеза B12 у микроорганизма Ps. de-nitrifleans выступает бетаин (триметилглицин).



Продуценты. Витамин синтезируют многие бактерии. Дрожжи и мицелиальные грибы не образуют корриноиды. В организме человека и животных витамин B12 синтезируется исключительно бактериальной микрофлорой кишечника.
Таблица 1. Образование витамина В12 различными штаммами

Штамм

Источник углерода

Выход, мг/л


Micromonospora sp. Nocardia rugo&a

Propionibacierium freudenreichii

Propionibaderium Khermanii

Propionibacterium vannielii

Pseudomonas denitr if leans Streptomyces olivaceus

Смешанная культура метаногенных

бактерий Bacterium FM-O2T

Methanobacillus omelianskii

Protaminobacter ruber

Corynebacterium и

Rhodopseudomonas

Nocardia gardnerii

глюкоза

глюкоза—тростниковая меласса

глюкоза

глюкоза

глюкоза

свеклосахарная меласса

глюкоза-лактоза

метанол

метанол метанол метанол н-парафины

гексаденан

11,5 14 25

23—40 25 59

35

2,6 8,8

2,5 2,3

4,5

В табл. 1 пе­речислены микроорганизмы, которые в силу высокого уровня биосинтеза кобаламинов в разное время рассматривались как его потенциальные продуценты в промышленности. В настоящее время в промышленности используют в основном три штамма бак­терий: Pseudomonas denitrificans, представителей рода Propioni-bacterium и метаногенные бактерии (смешанную культуру). Во всех случаях независимо от используемого штамма и условий культивирования в среду вводят ионы кобальта и часто 5,6 ДМБ. .Добавление таких предшественников корриноидов, как глицин, треонин, 6-АЛК и аминопропанол, может оказывать стимулиру­ющее действие на витаминообразование.

ПОЛУЧЕНИЕ


Получение витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В12 используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку син­тез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществля­ют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэроб­ных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе ста­дии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Ана­эробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирова­ния и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезиру­ют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10—100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10—100 мг/л), источники азота [(Nl-UhSCU]. В среду добавляют кукурузный экстракт (30—70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез ви­тамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии-культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5—7,0 путем введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевно­го материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим дав­лением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следую­щие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возмож­ны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

1) выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;

2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), ко­торый можно использовать в животноводстве;

3) дальнейшую очистку до уровня 91—98% (для медицинских целей).
Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°—120° в течение 10—30 мин при рН 6,1—8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или кле­точную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутст­вии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различ­ных носителях: амберлите IRC-50, А12О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом.

При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации.

Выход витамина B12 при использовании пропиоиовокислых бактерий - 25—40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода — 216 мг/л.

Получение витамина В12 с помощью бактерии Pseudomonas denitrificans

Ряд штаммов рода Pseudomonas образует в значительных количествах Bia, но чаще всего используют мутант Ps. denitriflcans, у которого в результате мутагенеза уровень витамина В12 удалось поднять с 0,6 мг/л (дикий штамм) до 60 мг/л. Бактерии культивируют с аэрацией и перемешиванием в периодических (или проточных) условиях в среде (а) следующего состава: свеклоса­харная меласса — 100 г, дрожжевой экстракт — 2 г, (NHtb НРО4 — 5 г, MgS04 — 3 г, MnS04 — 200 мг, CoNO3 — 188 мг, 5,6 ДМБ — 25 мг, ZnSO4 — 20 мг, Na2MoO3 — 5 мг, вода водо­проводная — до 1 л, рН 7,4. Меласса богата бетаином и глутаминовой кислотой, оказывающими положительный эффект на выход витамина. Бетаин стимулирует синтез б-АЛК и, возможно, также изменяет проницаемость мембраны.

Культуру сохраняют в лиофилизированном состоянии, поддерживают в вышеприведенной среде. Пересев осуществляют в про­бирку с плотной средой (б). Состав среды (б): свеклосахарная меласса — 60 г, пивные дрожжи — 1 г, N—Z-амин — 1 г, (МН4ЬНРО4 — 2 г, MgSO4 - 1 г, MnSO4 -- 200 мг, ZnS04 -20 мг, MoSO4 — 5 мг, агар — 25 г, вода водопроводная — до 1 л, рН 7,4. Инкубируют 4 дня при 28°. Далее клетки переносят в 150 мл жидкой среды того же состава (но без агара), налитую в литровую колбу Эрленмейера. Инкубируют 3 дня при 28° на качалке. Содержимое колбы вносят в ферментер на 5 л, содержащий 3,3 л среды (см. выше), стерилизованный 75 мин при 120°. Инкубируют 90 ч при 29° с перемешиванием (420 об/мин) и аэрацией (0,2 м3/ч). Чистый витамин В12 получают в результате проведения следующих последовательных операций:

Культуральная

жидкость с клетками

Ps. denitrificans (3,3л)
нагревание 30 мин при 20°С, охлаждение, доведение рН до 8,5, добавление KCN, перемешивание 16 ч при 25°, добавление ZnCl2 (200 г), доведение рН до 8,0, пе­ремешивание, фильтрация


Фильтрат



трехкратная экстракция 350 мл смесей крезола и угле­родистого тетрахлорида (1 : 2 — соотношение)

Органический

экстракт I
Водный экстракт


Трёхкратная экстракция 30 мл. смеси крезола и

углеродистого тетрахлорида (1:2 соотношения)
Органический

экстракт II
Добавление 200 мл ацетона и 120 мл эфира
Неочищенный витамин В12
В результате процесса экстракции получают цианкобаламин

98%-й чистоты и выходом 75%. Конечный выход — 59—60 мг/л, CN-кобаламин — стабильная форма витамина.


Получение витамина B12 с помощью метаногенных бактерий

В клетках метанобразующих бактерий витамин В12 присутствует от 4,1 нмоля/мг сухих клеток у Methanosarcina barkeri до 0,65 наномолей/мг сухих клеток у Metanobacterium formicum. Биосинтез кобаламинов архебактериями (изучали на М. barkei) сходен с биосинтезом корриноидов у анаэробных эубактерий. У метанотрофа Mtb. thermoautotrophicum большая часть клеточного кобамида локализована во фракции мембран и связана с мембранным белком. Предпо­лагают, что содержащий кобамид интегральный мембранный белковый комплекс играет существенную роль в метаболизме этих бактерий при утилизации H2 + CO2, которая, видимо, сводится к переносу электронов. Корриноиды у метанобразующих бактерий участвуют также в катаболизме ацетата и метанола. Превращение метанола в метан у Mis. barkeri происходит через образование СНз-СоМ, в метилировании которого за счет метанола участвуют две метилтрансферазы, зависимые от кобамида. Корриноид, видимо, служит простетической группой фермента.

Во Франции из ила сточных вод выделили мезофильные метаногенные бактерии и инкубировали их в ассоциации с другими бактериями в полупроточном режиме в среде, содержащей метанол (3—12 г/л), мелассу, кукурузный экстракт, NH4, Co, ортоксилидин и 5,6 ДМБ. Ферментацию ведут при 35° в ферментере на 1000 м3 с ежесуточной заменой 10% бродящего субстрата све­жей средой. Биомассу отделяют на сепараторах и высушивают на распылительной сушилке. Высушенный концентрат усредняют мелом до стандартной активности 1000 мкг/г препарата, который используют в таком виде как добавку к кормам. Сухой концент­рат до усреднения содержит —3000 мкг/г витамина B12 что со­ставляет 45—50% суммы корриноидов, фактор III - 10—15% и другие неполные корриноиды — 40—50%. Термофильные штаммы метанотрофных бактерий родов Methanobacillus и Methanobacterium образуют 2 мг/л кобаламина при содержании в среде 8 г/л метанола.

В России производство кормового препарата вита­мина B12 основано в основном на переработке барды (от­хода ацетоно-бутилового или спиртового производства) биоцено­зом бактерий, осуществляющих термофильное метановое броже­ние сточных вод.

Используют сложный консорциум анаэробных микроорганизмов, включающих углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие бактерии. К, барде добавляют метанол — до 2%, СоСl2-6Н2О — 10 г/м3, мочевину - 300 г/м3 и сухие кормовые дрожжи — 230 г/м3. Дозировку обогатителей производят автоматически.

Барду подают в нижнюю часть ферментатора метантенка (па 4—5 тыс. м3), в котором автоматически регулируют параметры процесса, обес­печивая контроль температуры (55—57°С), рН (7,5—8,0) и дли­тельности брожения. Брожение ведут непрерывно, ежесуточно заменяя 20—25% бродящей жидкости на свежую барду. В каче­стве пеногасителя используют рыбий жир.

Для получения кормового препарата бражку выпаривают и сушат. Поскольку витамин В!2 неустойчив при тепловой обра­ботке, особенно в щелочной среде, его стабилизируют. Для этого получаемую в процессе брожения жидкость перед выпариванием подкисляют до рН 5,0—5,3 и добавляют к ней сульфит натрия (0,1—0,25%). Содержание витамина В12 в исходной сброженной жидкости — 4,4 г/м3. Сгущение сброженной барды осуществля­ют на выпарных аппаратах (до 14—17% содержания сухих ве­ществ), а сушку в распылительной сушилке. Концентрация ви­тамина Bi2 в высушенном препарате — 500—600 мг/кг. Истинный витамин составляет 20—25% от суммы корриноидов, фактор III — 35—40%, фактор В и другие — 40—45%. Получаемый пре­парат называют КМБ-12.

Мезофильные и термофильные метаногенные бактерии, в том числе Metanobacterium thermoautotrophi-сит, Mb. thermoformicuin, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri, Ms. vacuolata, Ms. mazei, Methanococcus hatopilus, синтезируют исключительно фактор III.

Истинный витамин B12 образуют неспорообразующие метилотрофы: Eubacterium limosum, близкий к нему Butyribacterium methylotrophicum и Acetobacter woodi. Пу­тем создания искусственных биоценозов и подбора условий ферментации возможно целенаправленное регулирование процесса биосинтеза витамина В12.

Новые разработки. Для удешевления производства витамина B12 и утилизации дешевого возобновляемого сырья изучалось об­разование корриноидов бактериями Prop, atidipropionici ATCC 25562 при росте на ксилозе как главной составной части гидролизатов гемицеллюлоз. Используя ксилозу, бактерии аккумули­ровали 0,35 мг корриноидов в одном литре среды без внесения солей Со. Для продукции корриноидов из ксилозы больше всего подходит UFR-реактор, работающий с ультрафильтрационной ре­циркуляцией клеток.

Иммобилизованные клетки. В Японии сразнивали стабильность и продуктивность биокатализатора при включении клеток Propionibacterium sp. в гели каппа-каррагенана, Na-альгината, агара и форполимерные уретановые смолы. Оптимальной под­ложкой служит форполимер PU-9, полимерная матрица которой не снижала активности включенных в нее клеток. В оптимальных условиях ферментации 5 г иммобилизованных клеток вновь синтезировали и экскретировалн 900 мкг витамина за 18 дней повтор­ной периодической ферментации, продемонстрировав возмож­ность проведения многоступенчатого сложного синтеза (подобных примеров известно немного).

Усовершенствование штаммов-продуцентов. В последние годы усовершенст­вование штаммов было достигнуто путем мутаций и селекции. Этим методом в 50 раз увеличена продуктивность по витамину у Ps. denitrificans. Для грамположительных бактерий Propionibac-terium, Bacillus, Streptotnyces применимо слияние протопластов, для грамотрицательных бактерий, например Pseudomonas, до­ступны конъюгативные плазмиды, как Inc PI. Пока весомых практических результатов этими новыми и мощными методами не получено, но начало таким работам положено. Клонировали 11 генов, кодирующих ферменты биосинтеза витамина B12 у бактерии Вас. megaterium. Полагают, что в геноме содержится всего 20—30 та­ких генов. Поэтому DNA Вас. megaterium подвергли фрагментированию и крупные фрагменты встраивали в плазмиды, которы­ми далее трансформировали мутанты-ауксотрофы по В12. Такие мутанты приобрели способность синтезировать витамин В12. Ме­тод может быть использован для получения штаммов-продуцен­тов в производственных масштабах.

В бактерии Е. coll клонированы гены Prop, technicum, ответственные за синтез витамина В12. Бактерия Prop. technicum не содержит плазмид, по­этому из этого штамма выделили, очистили и частично разруши­ли ДНК, получив фрагменты 15—20 килобаз. Эти фрагменты включили в расщепленную плазмиду pBR 322 и полученной гиб­ридной плазмидой трансформировали Е. соli. Новые трансфор­манты отличались от контрольного штамма в отношении морфо­логических и физиологических признаков.


ЛИТЕРАТУРА


Быховский В. Я. Микробиологический синтез витамина Bi2. Сер. V. М., 1984.

Быховский В. Я., Панцхава Е. С. Промышленное получение витамина Bia методом метанового брожения. Пущино, 1983.

Воробьева Л. И. Микробиологический синтез витаминов. М., 1982.

Письменный В. В., Зыбин Н. С. и др. Автоматизация процессов про­изводства кормового концентрата витамина B12 ВНИИСЭНТИ. 1985. Сер. IX.

Поморцсва Н. В. Перспективы получения витаминов и коферментов с по­мощью микроорганизмов//Химико-фармацевтический журнал. 1986. № 8. С. 965—976.

Jeter R., Е s с а 1 а п t е - S e m е г е n a J. С. et al. Synthesis and use of vitamin Bi2//Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1987. Vol. 1. P. 551—556.

Kami kubo T, et al. Biological activities of new corrinoids//Agr. Biol. Chem. 1982. Vol. 46(6). P. 1673—1677.

La go B. D., K, a 1 a n L. Vitamin fermentations: B2 and B12. Adv. Biotechnol// //Proc. 6 Int. Perm. Symp. London, 1980. Vol. 3. P. 241—246.

Yongsmith В., Sonomoto K. et al. Production of vitamin Bi2 by immo­bilized cells of Propionic acid bacteria//Eur. J. Appl. Micr. Biotechnol. 1982. Vol. 16. P. 70—74.



Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал