«прогностическое значение компонентов врожденного иммунитета (tlr2, tlr4 и hbd1) у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции» 14. 00. 01 акушерство и гинекология 14. 00. 36 аллергология и иммунология



Скачать 312.8 Kb.
Дата29.04.2016
Размер312.8 Kb.
Просмотров18
Скачиваний0
ТипАвтореферат
На правах рукописи

Романовская Валентина Валерьевна

«ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА (TLR2, TLR4 И HBD1) У БЕРЕМЕННЫХ С ВЫСОКИМ РИСКОМ РЕАЛИЗАЦИИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ»
14.00.01 – акушерство и гинекология

14.00.36 – аллергология и иммунология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Москва – 2008г.
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор О.В. Макаров


доктор медицинских наук, профессор Л.В. Ганковская
Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Кузьмин

Московский Государственный медико-стоматологический университет
доктор медицинских наук, профессор М.А. Ботвин

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии


Защита диссертации состоится 9 февраля 2009 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета при Российском государственном медицинском университете по адресу 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан «18» декабря 2008г.


Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор А.З. Хашукоева


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Внутриутробная инфекция (ВУИ) является важной и нерешенной проблемой акушерства и перинатологии [Серов В.Н. и др., 2002; Володин Н.Н., 2002; Кулаков В.И. и др. 2004]. ВУИ развивается у 27,4 - 36,6% детей, рожденных живыми, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает ведущее положение, обусловливая от 11% до 45% потерь [Гриноу А. и др., 2002; Безнощенко Г.Б. и др., 2003; Goldenberg R.L. et al, 2003]. ВУИ является причиной широкого спектра патологии: невынашивания беременности, плацентарной недостаточности, инфекционных заболеваний плода, хронической гипоксии, мертворождений, пороков развития плода, синдрома задержки роста плода. Увеличение частоты данной патологии среди заболеваний новорожденных обусловлено увеличением количества женщин фертильного возраста с наличием той или иной урогенитальной инфекции [Кулаков В.И. и др., 2004].

Сложности антенатальной диагностики ВУИ связаны с полиэтиологичностью патологии, отсутствием четкой взаимосвязи между выраженностью клинических проявлений у матери и степенью поражения плода, многофакторным влиянием инфекционного агента на плод. Из-за неспецифичности клинических проявлений ВУИ диагностика ее во время беременности затруднена и возможна лишь при сочетанном использовании клинических и лабораторно – инструментальных методов исследования [Сидорова И.С., 2000; Кан Н.Е., 2005].

В возникновении ВУИ важную роль играют ограниченные возможности иммунной системы беременной к своевременному распознаванию и уничтожению этиологического агента инфекции. Иммунологическая защита против различных патогенов осуществляется в результате скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета [Сухих Г.Т, Ванько Л.В., 2003; Moffett A. et al., 2004]. Нарушение взаимодействия в гисто-иммунологических эпителиальных и плацентарных барьерах с различными инфекционными агентами сопровождается развитием инфекционного процесса у плода.

В последние годы появляются первые работы о роли механизмов врожденного иммунитета в репродуктивной функции человека [Gurelia I., 2000; Wira C.R., 2004; Schafer T.M., 2004; Romero R., 2005; Fazelil A., 2005]. Важное значение в развитии ряда патологических процессов, в том числе воспаления, имеют распознающие рецепторы врожденной иммунной системы: Toll-подобные рецепторы (TLRs) [Ковальчук Л.В. и др., 2005; Ганковская Л.В. и др., 2007; Мedzhitov R., Janeway JrC. A., 2000; Young S.L. et al, 2004]. Они обеспечивают интегрирующую и регулирующую роль в активации и реализации врожденного иммунного ответа на микробные патогены. TLRs, распознавая консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, увеличивают локальный синтез цитокинов, простагландинов, хемокинов и противомикробных пептидов, что запускает механизм реализации воспалительного ответа [Zhang D. et al, 2004; Abrahams V.M. et al, 2005]. Первым TLR, идентифицированным у человека, был TLR4. Этот рецептор распознает ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Наиболее широким спектром специфичности из всех идентифицированных TLRs обладает TLR2. TLR2 связывается с липопротеинами грамположительных и грамотрицательных бактерий, пептидогликаном и липотейхоевой кислотой грамположительных бактерий, грибковым зимозаном.

Экспрессия TLRs доказана в эпителии эндометрия и цервикального канала [Shaefer T.M. et al, 2004; Young S.L. et al, 2004]. Под влиянием различных микроорганизмов, инфицирующих эпителий цервикального канала, TLRs увеличивают локальный синтез провоспалительных цитокинов. Плацентарная ткань при нормальной доношенной беременности также экспрессирует ТLRs 1-10 на уровне генов [Abrahams V.M., Mor G., 2005]. Определенные внутриутробные инфекции во время беременности оказывают как прямое, так и непрямое влияние на выживание клеток трофобласта, что зависит от активации различных TLR.

В связи с этим особый интерес представляет изучение TLRs, как маркеров прогнозирования осложнений беременности.

Таким образом, в проблеме ВУИ вопросы ее диагностики и прогнозирования являются наиболее актуальными в настоящее время. Имеются основания предполагать, что применение современных технологий для выявления доклинических признаков ВУИ может обеспечить раннюю диагностику данной патологии и возможность новых подходов к разработке комплексных мер профилактики и лечения.


Цель исследования

Оценить прогностическую значимость комплексного исследования уровня экспрессии генов Тoll-подобного рецептора 2, Тoll-подобного рецептора 4 и противомикробного пептида HBD1 эпителием слизистой цервикального канала, клетками плаценты, мононуклеарными клетками крови при внутриутробной инфекции.

Задачи исследования


  1. Провести комплексное клинико-лабораторное обследование беременных с урогенитальной инфекцией для выявления группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции.

  2. Исследовать уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 у здоровых беременных в эпителиальных клетках цервикального канала, мононуклеарных клетках периферической крови и клетках плаценты.

  3. Исследовать уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 у беременных группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции в эпителиальных клетках цервикального канала, мононуклеарных клетках периферической крови и клетках плаценты.

  4. Оценить уровень экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 у здоровых беременных и беременных группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции.

  5. Определить роль параметров врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и HBD1, как возможных маркеров невынашивания беременности и реализации внутриутробной инфекции.

Научная новизна

Впервые в России проведена оценка экспрессии генов, распознающих рецепторов врожденного иммунитета (TLRs) и противомикробного пептида (HBD1) на системном и локальном уровнях при невынашивании беременности инфекционного генеза и внутриутробной инфекции.

Проведен анализ клинических проявлений ВУИ новорожденных и показана корреляция между повышением экспрессии гена TLR2 и снижением экспрессии противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты и эпителиальными клетками цервикального канала при реализации ВУИ, что говорит о дисбалансе в системе врожденного иммунитета.

Полученные данные об изменении экспрессии генов TLRs у беременных с урогенитальной инфекцией помогли расширить представление о роли механизмов врожденного иммунитета в патогенезе невынашивания беременности.

Современные методы изучения компонентов врожденного иммунитета во время беременности открывают новые возможности в лечении и профилактике осложнений.

Получен патент на изобретение №2334233 «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции».
Практическая значимость

Изучение социально – возрастного состава, а также соматического, и гинекологического статуса беременных позволяет определить факторы риска для развития ВУИ плода у женщин в период беременности. Формирование групп повышенного риска среди женщин во время беременности способствует своевременной диагностике и проведению профилактического лечения ВУИ плода на ранних стадиях его развития. Определение факторов риска развития ВУИ позволяет выделить когорту беременных для проведения динамического клинико-лабораторного контроля за состоянием будущей матери и плода с применением современных технологий.

Диагностика нарушений врожденного иммунитета дает возможность своевременно прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммунокорригирующей терапии у новорожденных.

Выявленные изменения в экспрессии гена TLR2, проявляющиеся в ее увеличении и, напротив, снижении экспрессии противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала могут быть рекомендованы в качестве маркеров ВУИ.


Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр акушерства и гинекологии, иммунологии Российского государственного медицинского университета.

Применение исследования экспрессии генa TLR2 эпителиальными клетками у беременных подтверждено патентом на изобретение «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции» № 2334233 20.09.2008г.
Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего ___ отечественных и ___ зарубежных источников. Работа выполнена на ___ страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и диаграммами.


Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии Российского государственного медицинского университета, сотрудников городской клинической больницы №55, городской клинической больницы №8 и медицинско-санитарной части №33 17 июня 2008 года.

Материалы диссертационной работы доложены на VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии, Москва, Россия, 11-13 сентября 2006г.; Х Всероссийском научном форуме 28 мая – 2 июня 2006г., «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»; V конференции иммунологов Урала, Оренбург, октябрь 2006г.; II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, 2007г.; конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии», Москва, 20 апреля 2007г.; II Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины памяти академика РАМН В.А.Таболина «Новые технологии в перинатологии», Москва, 1-2 октября 2007 г.
Публикации

По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них 4 статьи в центральной печати.

Положения, выносимые на защиту


  1. Наличие урогенитальной инфекции (УГИ) у беременной является фактором риска развития акушерских осложнений во время беременности и родов, выраженность которых зависит от вида инфекционного агента, фазы и длительности инфекционного процесса, активности врожденного иммунитета.

  2. Исследование компонентов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и HBD1 на локальном уровне (эпителиальные клетки цервикального канала и клетки плаценты) имеет важное значение в прогнозировании исходов беременности.

  3. Маркером реализации ВУИ является достоверное увеличение экспрессии гена TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала и клетках плаценты по сравнению со здоровыми беременными.

  4. При беременности и наличии урогенитальной инфекции маркером невынашивания беременности является дисбаланс компонентов врожденного иммунитета: повышение экспрессии генов TLR2 и снижение экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала и клетками плаценты.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование проводили на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (заведующий кафедрой профессор, д.м.н., заслуженный врач РФ О.В. Макаров) в родильном отделении городской больницы №8 ДЗ г.Москвы (главный врач А.Б. Дуленков) совместно с кафедрой иммунологии РГМУ (заведующий кафедрой академик РАЕН, профессор, д.м.н., Л.В. Ковальчук). Проведено клинико-лабораторное обследование 120 пациенток во время беременности и родов, а также их новорожденных в раннем неонатальном периоде. Основную группу составили 65 женщин с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась преждевременными родами. Часть из них поступала с дородовым излитием околоплодных вод. Данные больные представляли собой группу риска по реализации внутриутробной инфекции. Пациентки основной группы были разделены на две подгруппы для изучения с одной стороны, роли факторов врожденного иммунитета в патогенезе поздних прерываний беременности и преждевременных родов, с другой - в реализации внутриутробной инфекции. Недоношенные дети от 20 матерей 1а подгруппы имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции. 1б подгруппу составили 45 женщин, у их недоношенных новорожденных отсутствовали клинические признаки внутриутробной инфекции. Больные обеих подгрупп не получали иммуносупрессивную и антибактериальную терапию в качестве подготовки к беременности, в том числе и при первом исследовании эпителия цервикального канала и крови. Группу сравнения составили 25 беременных с УГИ, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации ВУИ в группе сравнения не было. Контрольную группу составили 30 женщин с физиологически протекающей беременностью, которая завершилась своевременными родами. У всех женщин контрольной группы была исключена УГИ. Критериями отбора в основную группу являлись: срок беременности 26-36 недель, невынашивание беременности инфекционного генеза, исключение генетических, анатомических и гормональных причин невынашивания беременности; отсутствие системных аутоиммунных заболеваний и гестоза; исключение оперативного родоразрешения; данная беременность у всех пациенток наступила без стимуляции овуляции.

В исследуемых группах изучали: данные анамнеза, течение настоящей беременности по триместрам, особенности родового акта, оценивали состояние новорожденных. Микробиологические методы исследования включали исследование отделяемого цервикального канала на следующие группы микроорганизмов: аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы, дрожжевые грибы. Видовая идентификация условно-патогенных микроорганизмов проводилась по общепринятым методикам, в соответствии с номенклатурой Берги. У всех выделенных культур определяли чувствительность к 10 антибиотикам диско-диффузионным методом. Вирусологические методы исследования - выявление ДНК HSVII, CMV, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum в соскобах эпителиальных клеток цервикального канала проводили методом полимеразной цепной реакции. Исследование системы гемостаза: проводили тромбоэластографическое исследование крови на тромбоэластографе фирмы Hellige (Германия). Агрегацию тромбоцитов определяли по методу J.U.Born, концентрацию фибриногена по методу Рутберг, продукты деградации фибрина и фибриногена с помощью полуколичественного латекс-теста, растворимые комплексы мономеров фибрина (РКМФ) с помощью протаминсульфатного теста по S. Niewiarowski, и этанолового теста по V. Gurevich H.I. Godal, U. Abilgaard. Гормональное исследование: 17-гидроксипрогестерона и гормонов щитовидной железы: тиреотропного гормона, свободного тироксина, свободного трийодтиронина осуществляли методом ИФА наборами фирмы DRG (США). Ультразвуковое исследование проводили при помощи аппарата Aloкa 4000 (Япония) с использованием трансабдоминальных и эндовагинальных датчиков. Допплерометрическое исследование кровотока в сосудах плода, плаценты и пуповины осуществляли при помощи ультразвуковых приборов Aloкa 4000 с доплеровской приставкой (Япония). Кардиотокографию проводили с 30 недель беременности при помощи кардиотокографа Corometrics 170 Series фирмы Н (Индия).

Патоморфологическое исследование плацент проводили в патологоанатомическом отделении Морозовской детской городской клинической больницы №1. Макроскопически изучали особенности последа, у плодовых оболочек определяли нарушения целостности, цвет, вид поверхности. Микроскопическое исследование плаценты проводили по определенной схеме с изучением морфологической картины хориальной пластинки, ворсинчатого хориона, состояния межворсинчатого пространства и базальной мембраны.

Иммунологические исследования были проведены на кафедре иммунологии РГМУ и в лаборатории диагностики вирусных инфекций ГУ «НИИ вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН» со с.н.с., к.м.н. Ганковской О.А. К иммунологическим и молекулярно-генетическим методам исследования относились методы определения уровня экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD1 в различных биологических средах: клетками слизистой цервикального канала и плаценты, мононуклеарными клетками крови. Для изучения экспрессии генов были использованы следующие методы: выделение общей РНК, реакция обратной транскрипции и полимеразная реакция в реальном времени. Клинические образцы (клетки слизистой цервикального канала, гомогенизат плаценты, мононуклеарные клетки) подвергали лизису и из лизата выделяли РНК. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, были моделированы с помощью программы VectorNTI 8,0.

Результаты и их обсуждение

Как указывалось выше, в данное исследование было включено 120 пациенток. В основную группу входили женщины с наличием УГИ и невынашиванием беременности инфекционного генеза (в 1а подгруппе - недоношенные дети имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции; в 1б подгруппе - клинические признаки внутриутробной инфекции отсутствовали). Группу сравнения составили пациентки с УГИ, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации внутриутробной инфекции не было (3). Контрольную группу составили здоровые женщины с физиологически протекающей беременностью, которая завершилась своевременными родами (2). Средний возраст в исследуемых группах составил 25,7±0,26 лет, с индивидуальными колебаниями от 19 до 42 лет. При клиническом анализе было выяснено, что пациентки I, II, III групп достоверно не отличались по возрасту, наследственности, характеру менструальной функции.

Большинство пациенток 1-ой группы вступило в беременность с отягощенным инфекционным и соматическим анамнезом. При изучении данных инфекционного анамнеза было выявлено, что 64,6% пациенток 1-ой группы ранее перенесли детские инфекции, 57% женщин - ОРВИ. Во 2-ой группе их количество было меньшим (30% и 20% соответственно). Большая часть женщин 1-ой группы вступило в беременность с наличием отягощенного гинекологического анамнеза. У 29,4% пациенток 1-ой группы в анамнезе имели место медицинские аборты и самопроизвольные выкидыши.

В структуре гинекологической патологии обеих групп превалировали заболевания воспалительного генеза. Наиболее частыми заболеваниями в структуре гинекологической патологии являлись воспалительные заболевания матки и придатков, а также различная патология шейки матки.

В структуре бактериальной инфекции у пациенток 1-ой группы наиболее часто во время беременности выявлялись: Ureaplasma urealyticum (29,2%) и Chlamydia trachomatis. На втором месте по частоте встречаемости – Candida 27,7%. На третьем месте – вирусная инфекция: HSVII в 16,9%, CMV 13,9% (рис.1). Данные лабораторного обследования подтвердили инфекционный генез невынашивания у беременных основной группы.


Рис.1 Структура возбудителей УГИ у беременных основной группы и группы сравнения(%)



*Уровень значимости различий по критерию Стьюдента р<0,05 по сравнению с 3 группой

гр.1а беременные с УГИ, с реализацией ВУИ, преждевременные роды

гр.1б беременные с УГИ, без реализации ВУИ, преждевременные роды

гр.3 беременные с УГИ, своевременные роды
Субклиническое течение инфекционного процесса без выраженных системных изменений у беременных подтверждало гистологическое исследование плацент.

Нами было проанализировано течение беременности и родов у пациенток 1-ой и 2-ой групп. При этом оценивали частоту акушерских осложнений в зависимости от вида действующего патогенного микроорганизма. Наличие активной инфекции может способствовать развитию патологии сократительной деятельности матки, провоцируя угрозу выкидыша и преждевременных родов. Так, угроза прерывания беременности развилась у 45% пациенток 1а подгруппы (с реализацией ВУИ) и 26,7% 1б подгруппы основной группы, что в 2 раза выше, чем у женщин контрольной группы (13,3%) (рис.2).

Рис.2 Угроза прерывания беременности у беременных исследуемых групп (%)


*


* Уровень значимости различий по критерию Стьюдента р<0,05 по сравнению с группой контроля

Характерным осложнением во время беременности среди женщин основной группы с наличием УГИ также является изменение индекса амниотической жидкости, причем как в сторону многоводия, так и маловодия. У здоровых беременных многоводия не отмечалось. Так, у беременных 1а подгруппы с реализацией ВУИ маловодие и многоводие в III триместре развивалось чаще (20%). У здоровых пациенток в 3,3% отмечалось маловодие (рис.3).

Рис.3 Частота развития многоводия и маловодия среди пациенток

исследуемых групп (%)




*

*

*


* Уровень значимости различий по критерию Стьюдента р<0,05 по сравнению

с группой контроля
Среди других осложнений беременности отмечалась относительно стабильная частота развития анемии различной степени выраженности: беременные 1-ой и 2-ой групп - 15,3% и 3,3% соответственно. Плацентарная недостаточность выявлена при УЗИ и была подтверждена гистологически у 35,5% пациенток 1а подгруппы (с реализацией внутриутробной инфекции), у 15,5% пациенток в 1б подгруппе, у здоровых беременных в 3,3%. Хроническая внутриутробная гипоксия плода диагностирована у 15% пациенток 1а подгруппы (с реализацией ВУИ), в то время как среди здоровых пациенток данное акушерское осложнение не наблюдалось.

Таким образом, влияние бактериальной и вирусной инфекции на течение беременности выражается в развитии ряда осложнений беременности, наиболее характерными из которых являются: угроза прерывания беременности, плацентарная недостаточность, многоводие, маловодие.

У 67,7% пациенток основной группы недоношенная беременность осложнилась преждевременным разрывом плодных оболочек. В группе сравнения при наличии УГИ и доношенной беременности отмечалось дородовое излитие околоплодных вод у 8%, раннее излитие околоплодных вод у 10% здоровых пациенток.

Нами проведено комплексное определение количественной экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 клетками слизистой цервикального канала, клетками плаценты и мононуклеарными клетками периферической крови. Результатом активации TLRs, распознающих консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, является увеличение локального синтеза цитокинов, хемокинов и противомикробных пептидов. В связи с этим, проводилось определение экспрессии гена противомикробного пептида HBD-1 в слизи цервикального канала, клетками плаценты и мононуклеарными клетками периферической крови.

При физиологически протекающей беременности уровень экспрессии генов TLR2 и TLR4 были различны. Экспрессия TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала превышала уровень экспрессии TLR4 в девять раз (TLR2 1,87±0,35х105 копий гена, TLR4 0,21±0,01х105) (р<0,05) (рис.4). Повышенная экспрессия TLR2 клетками слизистой цервикального канала показана и у здоровых небеременных женщин [Fazelil A. et al, 2005].

Рис.4 Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов эпителиальными клетками цервикального канала, клетки плаценты




*


* р<0,05 уровень значимости по критерию Манна-Уитни

По оси ординат абсолютные значения количества копий гена
В клетках плаценты, мононуклеарных клетках периферической крови экспрессия TLR2 также превышала уровень экспрессии TLR4 (рис.4). Это можно объяснить более широким спектром микробных агентов, распознаваемых TLR2.

При исследовании экспрессии генов TLR2 и TLR4 клетками плаценты у беременных с урогенитальной инфекцией и благоприятным исходом беременности - своевременными родами (группа сравнения), возрастает экспрессия гена TLR2 (122,64±16,76х105 копий гена) в 2 раза по сравнению со здоровыми беременными из группы контроля (59,19 ±5,85х105) (р<0,05), уровень ТLR4 достоверно не изменялся. Таким образом, определенный уровень защиты от инфекционных агентов обеспечивается повышенной экспрессией TLR2 по сравнению с группой женщин с физиологически протекающей беременностью.

При сопоставлении уровня экспрессии TLR2 у женщин в конце второго, третьем триместре с исходами беременностей удалось установить взаимосвязь многократного его повышения с развитием преждевременных родов. При невынашивании беременности инфекционного генеза (беременные основной группы) нами было отмечена гиперактивация экспрессии гена ТLR2 - (458,97±36,06х105 копий гена), в 7,8 раза по сравнению с нормой (59,18±5,85х105) (р<0,05). Нами отмечена взаимосвязь высокого уровня экспрессии TLR плацентой с развитием ПРПО. У 44 пациенток с наличием урогенитальной инфекции и несвоевременным излитием вод, входящих в основную группу, уровень экспрессии клетками плацентой TLR2 превышал нормативные в 5раз (р<0,05), TLR4 в 1,5 раз.

Также нами проанализированы показатели экспрессии генов TLRs у беременных основной группы с хронической плацентарной недостаточностью и сопоставлены с данными морфологического исследования плацент. Как показали результаты гистологического исследования, в основной группе выявлены расстройства кровообращения в виде расширения кровеносных сосудов, тромбоза сосудов различного калибра в строме ворсин и в межворсинчатом пространстве. Наряду с сосудистыми нарушениями выявлены дистрофические изменения в виде гипоплазии плаценты, снижения ее массы и повышенного отложения фибриноида. Оболочки последов с реализацией ВУИ имели полиморфноклеточную лейкоцитарную инфильтрацию. Данные проведенных исследований свидетельствуют о связи между 5-8 кратным повышением уровня экспрессии TLR2 плацентой с развитием гемодинамических и дистрофических нарушений в плацентах.

У беременных с невынашиванием беременности инфекционного генеза экспрессия гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала возрастала в 8,7 раз по сравнению с группой здоровых беременных (рис.5). Уровень экспрессии гена TLR4 при наличии УГИ увеличивался в 1,3 раза по сравнению с группой контроля. Следовательно, эпителиальные клетки могут осуществлять иммунный ответ на микроорганизмы через TLRs, которые играют важную роль в осуществлении механизмов защиты во время беременности. Нарушение механизмов иммунного ответа, в частности, гиперэкспрессия TLRs под воздействием инфекционных агентов приводит к невынашиванию беременности.

Рис.5 Экспрессия гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала

при преждевременных родах и ВУИ



*уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с группой контроля

по оси ординат абсолютные значения количества копий гена
Экспрессия генов TLRs мононуклеарными клетками периферической крови изучалась во втором и третьем триместрах беременности у женщин всех групп, так как TLRs широко экспрессируются клетками, участвующими в воспалительном ответе: моноцитами, макрофагами, нейтрофилами и др. Полученные данные сопоставлялись с результатами экспрессии генов TLRs на локальном уровне (клетки плаценты и эпителий цервикального канала).

Среди больных с урогениальной инфекцией, независимо от исходов беременности, нами не установлено достоверного изменения экспрессии гена TLR2 мононуклеарными клетками. Экспрессия TLR4 увеличивалась при наличии урогениальной инфекции и развитии преждевременных родов, но не более, чем в три раза. Сопоставив эти данные, мы пришли к выводу, что ответ врожденного иммунитета на инфекционные патогены через TLRs, отмечается только на локальном уровне. Нами выявлены нарушения экспрессии генов TLRs клетками плаценты и эпителия цервикального канала при развитии осложнений беременности, на системном уровне достоверного изменения экспрессии не отмечалось.

Увеличение экспрессии TLRs в ответ на инфекционные патогены приводит к активации каскада адапторных молекул и продукции провоспалительных цитокинов и хемокинов. Одним из классов биологически активных веществ, вырабатываемых в ответ на активацию TLRs, являются противомикробные пептиды. Нами была изучена у беременных всех групп экспрессия гена противомикробного пептида HBD1, который относится к β-дефензинам, и синтезируются не только фагоцитами, но и клетками поверхностных тканей – эпителием [Pivarcsi A. et al, 2005]. HBD1 экспрессируется во влагалище, эндометрии, маточных трубах. При беременности HBD1 экспрессируется в хорионе, плаценте [Feng Y. et al, 2003].

При нормальной физиологической беременности (группа контроля) экспрессия эпителиальными клетками слизистой цервикального канала: 2,51±0,12х104 копий гена; мононуклеарными клетками периферической крови: 3,95±0,64х104; плацентой: 5,69±0,6х104. Нами установлена взаимосвязь низких уровней экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 мононуклеарными клетками периферической крови, клетками плаценты, эпителиальными клетками цервикального канала с развитием преждевременных родов в основной группе. Преимущественно снижение экспрессии HBD1 отмечалось эпителиальными клетками цервикального канала – в 6,4 раза по сравнению с контролем (2,51±0,12х104 копий гена в группе контроля, 0,39±0,02х104 в основной группе) (р<0,05) (рис.7). Однако, в группе сравнения у беременных с УГИ и благоприятным исходом – своевременными родами без реализации ВУИ определялся повышенный уровень экспрессии гена HBD1 мононуклеарными клетками периферической крови и эпителием цервикального канала: 3,96±0,64х104 (группа контроля)/30,71±4,1х104 (группа сравнения); 2,5±0,15х105 (группа контроля)/3,14±0,23х104 (группа сравнения) соответственно (р<0,05) (рис.6).

Рис.6 Экспрессия гена HBD1 в клетках плаценты и эпителиальных клетках цервикального канала при преждевременных родах

инфекционного генеза.




*

*


*уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с группой контроля

по оси ординат абсолютные значения количества копий гена
Нами была проанализирована структура патологии новорожденных, родившихся от пациенток, включенных в исследование. От 120 матерей родились живыми 118 новорожденных. В двух случаях отмечалась интра- и антенатальная гибель детей с экстремально низкой массой тела в результате глубокой недоношенности и асфиксии. В основной группе у 65 беременных с преждевременными родами родились недоношенные дети в сроке гестации 26-36 недель. У 20 детей от матерей данной группы были клинические признаки ВУИ, состояние при рождении данных детей было тяжелое, обусловленное недоношенностью и внутриутробной инфекцией. В группе контроля у 30 беременных с нормально протекающей беременностью и своевременными родами дети родились доношенными. Все новорожденные данной группы родились в удовлетворительном состоянии без видимых пороков развития. В группе сравнения родились доношенные дети от 25 беременных с урогенитальной инфекцией. Преимущественно дети из основной группы требовали длительного лечения, в основном по поводу недоношенности и внутриутробной пневмонии с переводом на второй этап выхаживания 70% (14) из 1а подгруппы с реализацией ВУИ, 42,2% (19) из 1б подгруппы без реализации ВУИ. Длительность пребывания в стационаре недоношенных новорожденных детей колебалась от 10 до 40 дней.

В 1а подгруппе основной группы недоношенных новорожденных с реализацией ВУИ от матерей с УГИ оценка состояния новорожденных по Апгар на 1 и 5 минуте составляла соответственно 6,1±0,4 и 6,4±0,6 баллов. Средняя масса таких детей при рождении 1730±134 грамм. В 1б подгруппе основной группы недоношенных детей без реализации ВУИ от матерей с УГИ, соответственно 7,0±0,3 и 7,75±0,3 баллов, средняя масса детей составила 2410±103 грамм. В массо-ростовых показателях не было достоверных различий между группой сравнения и контрольной группой: в группе здоровых беременных оценка состояния новорожденных составила 8,5±0,4 и 8,6±0,38 баллов, средняя масса – 3430±148г, в группе сравнения оценка по шкале Апгар 7,7±0,33 и 8,4±0,36 баллов, масса 3590±154.

Наличие признаков ВУИ было исследовано в основной группе у недоношенных детей от матерей с УГИ. При анализе течения раннего неонатального периода отмечена наибольшая частота реализации ВУИ - развития внутриутробной пневмонии в основной группе при преждевременных родах – 24,6% (16). Другие клинические проявления ВУИ у детей, рожденных матерями 1-ой группы: кандидоз, энтероколит, кожно-геморрагический синдром и др. отмечались примерно с одинаковой частотой, и нередко имело место сочетание двух и более признаков у одного ребенка.

Также у новорожденных от женщин основной группы чаще отмечались неспецифические клинические признаки, такие как отечный синдром (11%), гипербилирубинемия (18,5%), свидетельствующие о напряженном состоянии адаптационных механизмов в условиях отрицательного влияния инфекционного и гипоксического факторов. У 40% (26) детей от матерей основной группы отмечалось развитие гипоксического поражения ЦНС, у 20% отмечалось ВЖК различной степени. Достоверного различия недоношенных детей с СЗРП от матерей основной группы с УГИ и доношенных детей с СЗРП от матерей группы сравнения не отмечалось (4,6% и 4,0% соответственно).

Всем новорожденным детям проводилось отсасывание слизи из верхних дыхательных путей и подача тепла. В основной группе проводили реанимационные мероприятия, причем в ИВЛ нуждались 17% детей (11). В группе контроля ИВЛ не проводилось, у 2 детей проводилась кратковременное ИВЛ - мешком Амбу в связи с возможной медикаментозной депрессией. В группе сравнения у одного ребенка проводилась ИВЛ, в связи с асфиксией.

Мы проводили клинико-иммунологические параллели между изменением уровня экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета: ТLR2 и ТLR4 клетками плаценты, эпителия цервикального канала и мононуклеарными клетками периферической крови женщин основной группы и наличием реализации ВУИ их новорожденных. В этом же контексте проведен анализ экспрессии гена противомикробного пептида HBD1, так как сигнальная функция TLRs осуществляется путем индукции экспрессии дефенсинов, обладающих способностью уничтожать микроорганизмы и стимулировать фагоцитоз.

Анализ средних значений экспрессии генов TLRs клетками плаценты у пациенток основной группы показал достоверное и значительное их повышение при реализации внутриутробной инфекции новорожденных. Экспрессия гена ТLR2 при невынашивании беременности инфекционного генеза и реализации внутриутробной инфекции новорожденных в 7 раз превышала норму (группа контроля - здоровые беременные – 59,19±5,85х105 копий гена, группа с реализацией ВУИ – 420,48±36,02х105) (р<0,05), ТLR4 в 3 раза (группа контроля - 0,59±0,06х105, 1а подгруппа с реализацией ВУИ – 1,77±0,28 х105) (р<0,05) (рис.7).
Рис.7 Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов клетками плаценты при преждевременных родах и ВУИ.



По оси ординат - отношение показателя экспрессии гена TLR исследуемой группы по сравнению с контролем (показатель контроля принят за единицу)

*Уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с группой контроля

Экспрессия гена TLR2 эпителием цервикального канала при реализации ВУИ возрастала в 30 раз (группа контроля – здоровые беременные – 1,87±0,35х105 копий гена, 1а подгруппа – с реализацией ВУИ 59,14±9,43) (р<0,05) (рис.5). При изучении экспрессии гена TLR4 эпителием цервикального канала у группы беременных с реализацией ВУИ оказалось, что уровень экспрессии превышал контрольный в 3,5 раза.

При изучении экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 у женщин, родивших детей с признаками ВУИ, уровень экспрессии гена HBD1 уменьшался, более выраженное изменение отмечалось в плаценте – в 3,24 раза по сравнению с нормой (группа контроля – здоровые беременные – 5,69±0,59х104 копий гена, 1а подгруппа – с реализацией ВУИ – 1,76±0,22х104) (р<0,05).

Итак, по отношению к HBD1 установлена обратная зависимость – достоверное снижение значений экспрессии гена у беременных с невынашиванием беременности и реализацией ВУИ новорожденных (рис.8). Экспрессия TLRs при данных осложнениях, наоборот, резко возрастает. В группе сравнения при урогенитальной инфекции и благоприятным исходом беременности у беременных женщин наблюдается увеличение уровня экспрессии гена HBD1, реализации ВУИ их новорожденных не наблюдалось. Это, по-видимому, можно объяснить неполноценностью механизмов противомикробной защиты на границе мать-плод, следствием чего и является распространение инфекции.

Рис.8 Экспрессия гена HBD1 клетками плаценты и мононуклеарными клетками периферической крови при ВУИ.


*уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с группой контроля

по оси ординат абсолютные значения количества копий гена
Таким образом, можно предположить, что иммуногенетические особенности могут приводить к неполноценности системы врожденного иммунитета, как одного из основных факторов защиты от инфекции в системе мать-плод. Изучение рецепторов сигнальной трансдукции TLRs в цепи: лиганд (патоген) – рецептор – сигнал – клеточный ответ – позволяет по новому осмыслить функциональное значение врожденного иммунитета при беременности.

Нами приведены результаты изучения показателей врожденного иммунитета в норме у беременных, а также убедительные данные о Toll-опосредованной патологической гиперактивации врожденного иммунитета при инфекции у беременных, которая является причиной, приводящей к невынашиванию беременности, активации внутриутробной инфекции и другим осложнениям. Показано, что TLRs, как основные рецепторы врожденного иммунитета, могут служить маркерами осложнений беременности, а также потенциальной мишенью новых терапевтических вмешательств.

Сочетание повышенной экспрессии гена TLR2 и недостаточной экспрессии гена HBD1 является чувствительным тестом, позволяющим выделить группу риска по возникновению преждевременных родов. Дисбаланс параметров врожденного иммунитета наблюдался при реализации ВУИ.

Исследование параметров врожденного иммунитета на ранних сроках беременности позволяет прогнозировать вероятность развития данных осложнений, и своевременно назначать и проводить корригирующую терапию.


Выводы.

1. Факторами риска реализации ВУИ являются наличие УГИ во время беременности в сочетании с хронической инфекцией, воспалительными заболеваниями органов малого таза и/или с угрозой прерывания беременности, преждевременного разрыва плодных оболочек, плацентарной недостаточностью, хронической внутриутробной гипоксией плода, изменением индекса амниотической жидкости – маловодия и многоводия.

2. При физиологической беременности уровень экспрессии генов TLR2 и TLR4 в клетках плаценты превышает уровень экспрессии этих рецепторов в эпителиальных клетках цервикального канала. При этом уровень экспрессии гена TLR2 значительно превосходит TLR4 .

3. В группе пациенток с УГИ, родивших детей с признаками внутриутробной инфекции, отмечается гиперэкспрессия гена TLR2 (клетками эпителия цервикального канала в 30 раз, клетками плаценты в 7 раз) по сравнению со здоровыми беременными.

4. Дисбаланс компонентов врожденного иммунитета: снижение экспрессии HBD1 и гиперэкспрессия TLR2 и в эпителиальных клетках и в клетках плаценты является маркерами развития осложнений беременности: преждевременных родов инфекционного генеза и реализации ВУИ.

5. Исследование параметров врожденного иммунитета (TLR2, TLR4, HBD) в мононуклеарных клетках периферической крови малоинформативно.

Практические рекомендации

1. Выявление факторов повышенного риска развития ВУИ у беременных (острая или рецидив хронической инфекции во время настоящей беременности, наличие воспалительных заболеваний тазовых органов, ПРПО, плацентит, маловодие, многоводие, хроническая гипоксия плода) дают основание относить данный контингент к группе высокого риска по её развитию, и, соответственно, подвергать целенаправленному обследованию.

2. Для своевременной диагностики и прогнозирования инфекционного процесса у плода и новорожденного в алгоритм клинико-лабораторного обследования целесообразно включать комплексное исследование экспрессии генов TLR2 и HBD1 клетками эпителия цервикального канала и клетками плаценты в группе пациенток повышенного риска по реализации ВУИ.

3. Достоверное повышение экспрессии гена TLR2 клетками эпителия цервикального канала по сравнению со здоровыми беременными позволяет отнести данных пациенток в группу риска по ВУИ.

4. Сочетание увеличения экспрессии гена TLR2 клетками эпителия цервикального канала и снижения экспрессии противомикробного пептида HBD1 по сравнению со здоровыми беременными может служить прогностическим критерием развития преждевременных родов, что позволяет проводить своевременную терапию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.



  1. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Увеличение уровня эксрессии ТLR2 у беременных женщин при урогенитальной инфекции. Материалы ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии», Москва, 21-22 ноября «Вопросы практической педиатрии», 2006г., Том 1, №4, с.36

  2. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Оценка уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов при урогенитальной инфекции. Материалы VIII Всероссийского форума «Мать и дитя», Москва, 3-6 октября, 2006г., с.353

  3. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Экспрессия ТLR4 клетками цервикального канала у беременных женщин при урогенитальной инфекции. Материалы ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии», Москва, 21-22 ноября 2006, Вопросы практической педиатрии, 2006г., Том 1, №4, с.37

  4. Ганковская Л.В., Романовская В.В., Фензелева В.А. Увеличение уровня экспрессии TLR2 у беременных женщин при урогенитальной инфекции. Аллергология и иммунология в педиатрии, Москва, 2006, №2-3(9), с.66

  5. Ганковская О.А., Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Макаров О.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская Л.В Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета при урогенитальной инфекции у беременных. Сборник тезисов докладов V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии», Оренбург, 2006г., с.47

  6. Ганковская О.А., Романовская В.В., Сомова О.Ю. Экспрессия Toll-подобных рецепторов у беременных женщин больных генитальным герпесом. Тезисы докладов Международной конференции «Генетика в России и в мире», 2006, Москва, с.43

  7. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Роль врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. Материалы I международного семинара «Инфекция в акушерстве и перинатологии» Москва, Россия, 3-6 апреля 2007г., с.94

  8. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Романовская В.В. Роль механизмов врожденного иммунитета у беременных женщин с урогениальной инфекцией. Сборник Материалов ХIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 16-20 апреля, 2007г., с.538

  9. Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Роль Toll-подобных рецепторов при патологии беременности, «Медицинская иммунология». 2007г., Москва, Том 9, №2-3, с. 256-257.

  10. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы в инициации невынашивания беременности. «Вопросы практической педиатрии», 2007г., Том 2, №5, с.26

  11. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Молекулярные механизмы врожденного иммунитета при невынашивании беременности. Материалы первого регионального научного форума «Мать и дитя», Казань, 2007г., с.102

  12. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы в инициации невынашивания беременности. Материалы IХ Всероссийского форума «Мать и дитя», Москва, 2007г., с.150

  13. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Показатели врожденного иммунитета при невынашивании беременности. Материалы IХ Всероссийского форума «Мать и дитя», Москва, 2007г., с.151

  14. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Роль механизмов врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. V Всемирный конгресс по иммунопатологии и аллергии, V Европейский конгресс по астме, «Аллергология и иммунология», Том 8, №1, Москва, 21-24 апреля 2007г., с.122

  15. Фензелева В.А., Карташов Д.Д., Романовская В.В. Экспрессия мРНК Toll-подобного рецептора 2 и бета-дефензина человека-1 при урогенитальной инфекции беременных. «Вестник Российского Государственного Медицинского Университета» №2(55), Москва, 2007г., с.321

  16. Романовская В.В., Фензелева В.А. Инфекционный патогенез невынашивания беременности. «Вестник Российского Государственного Медицинского Университета» №2(55), Москва, 2007г., с.359

  17. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы как маркеры осложнений беременности. «Аллергология и иммунология» Том 8, №3, Москва, 2007г., с.236

  18. Макаров О.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Романовская В.В. Современные подходы к прогнозированию преждевременных родов. «Российский вестник акушера-гинеколога», 2007, Том 7,  №6. - с.10-15.

  19. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Оценка уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов при урогенитальной инфекции. Сборник Материалов ХV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля, 2008г., с.353

  20. Романовская В.В., Фензелева В.А. Иммунологические аспекты невынашивания беременности при урогенитальной инфекции. «Вестник Российского Государственного Медицинского Университета» №3(62), Москва, 2008г., с. 119

  21. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы в генезе невынашивания беременности. «Акушерство и гинекология», 2008, №2. – с. 22-28.

  22. Макаров О.В., Козлов П.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Кузнецов П.А. Основные аспекты ведения недоношенной беременности и преждевременных родов. «Акушерство и гинекология», 2008, №5. – с.19-24

  23. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Прогностическое значение Toll-подобных рецепторов и противомикробного пептида HBD1 у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции их новорожденных. «Вопросы практической педиатрии», Материалы III Ежегодного конгресса и VI Съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины, «Современная перинатология: организация, технология и качество» 2008, Том 3, №5, с. 34.

  24. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Прогностическое значение Toll-подобного рецептора 2 и противомикробного пептида HBD1 у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции их новорожденных, Материалы IV Съезда акушеров-гинекологов России, 2008, с.151-152.

  25. Ганковская О.А., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Романовская В.В., Фензелева В.А. Роль Toll-подобных рецепторов и дефензинов в противомикробной защите урогенитального тракта женщин, «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии», 2008, №1 январь-февраль, с.46-50

  26. Gankovskaya O.A., Romanovskaya V.V., Kuznecov P.A., Fenzeleva V.A., Kartashov D.D. TLR and antimicrobial peptide genes expression during prenatal infection Abstract from Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Kyiv, Ukraine, 20-22 september, 2007, p.165

  27. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции», Официальный бюллетень федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.06.2008г.


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал