Разработка и оценка адекватности in vivo моделей для исследования сердечно-сосудистой системы 03. 00. 13 физиология 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология



страница1/3
Дата23.09.2017
Размер1.57 Mb.
Просмотров45
Скачиваний0
ТипАвтореферат диссертации
  1   2   3



На правах рукописи



МУРАШЕВ АРКАДИЙ НИКОЛАЕВИЧ


РАЗРАБОТКА И ОЦЕНКА АДЕКВАТНОСТИ IN VIVO МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ

03.00.13 - физиология

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук



Пущино - 2007

Работа выполнена в ФИЛИАЛЕ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (г. Пущино)

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Медведев Олег Стефанович

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Каркищенко Николай Николаевич

доктор медицинских наук, профессор

Маевский Евгений Ильич

доктор биологических наук Тарасова Ольга Сергеевна

Ведущая организация:

Институт нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН
Защита состоится «24» октября 2007 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290 г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290 г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3. ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан "____" _____________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

Н.Ф.Ланина



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных задач экспериментальных биомедицинских исследований является то, в какой степени результаты, полученные на лабораторных животных можно экстраполировать на организм человека. К настоящему времени описано множество in vivo моделей. Однако в большинстве случаев вопрос об адекватности той или иной биомодели процессам, протекающим в организме человека, остается открытым, поэтому актуальность данной проблемы очевидна.

От того, насколько модель на лабораторных животных будет адекватна организму человека, зависит формирование представлений о механизмах физиологических процессов, ответственных за реализацию действия фармакологических препаратов, и стратегия выбора новых физических агентов и химических веществ с определенными физиологическими и фармакологическими свойствами. Оценка адекватности экспериментальных моделей представляет собой систему доказательств, показывающих в какой мере и с какой степенью вероятности результаты, полученные в эксперименте на животных, могут быть экстраполированы на человека.

В биомоделировании принцип подобия является основополагающим. При разработке in vivo моделей обычно используют следующие методические приемы: селекция по заданному фенотипическому признаку физиологического или патологического состояния; модификация генотипа, приводящая к изменению протекания физиологических процессов или развитию патологии (трансгенные и нокаутные животные); фармакологическая модуляция функционального состояния или инструментальные воздействия на организм, провоцирующие физиологические или патологические изменения в нем; изменения внешних условий среды обитания, приводящие к мобилизации физиологических механизмов адаптации вплоть до их истощения и патологии.

Фармакологическая коррекция нарушений сердечно-сосудистой системы является одной из важнейших проблем современной медицины. В связи с этим, разработка и оценка адекватности организму человека in vivo моделей для изучения сердечно-сосудистой системы является важной и актуальной проблемой.



Цель и задачи исследования. Цель работы – разработка и оценка адекватности соответствующим процессам, протекающим в организме человека, in vivo моделей для исследования сердечно-сосудистой системы.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1) провести комплексное изучение параметров сердечно-сосудистой системы у гипертензивных крыс SHR-SP (Spontaneous Hypertensive Rat Stroke Prone) в сравнении с нормотензивными крысами WKY с целью оценки адекватности перестройки регуляторных механизмов в условиях повышенного артериального давления (АД) у крыс процессам, развивающимся при артериальной гипертонии у человека;

2) исследовать аритмогенные свойства эндотелина при его внутривенном введении у бодрствующих мышей и крыс и изучить роль нервной системы в развитии нарушения ритма сердца, вызванного эндотелином в условиях блокады NO-синтазы;

3) создать адекватную модель глобальной ишемии головного мозга и провести морфо-функциональное исследование на бодрствующих крысах SHR-SP, моделируя у них глобальную ишемию головного мозга путем билатеральной окклюзии сонных артерий;

4) разработать модель для изучения транскапиллярного обмена жидкости на крысах и оценить ее адекватность;

5) провести сравнительный анализ гемодинамических эффектов у нормотензивных и гипертензивных крыс при воздействии физиологических (иммобилизационного стресса) и фармакологических (антидепрессантов) факторов, а также агентов парокринной системы клеток эндотелия кровеносных сосудов (эндотелина и оксида азота).

Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный анализ функциональных характеристик сердечно-сосудистой системы у крыс SHR-SP, и показано, что крысы SHR-SP являются адекватной экспериментальной моделью артериальной гипертонии. Обнаружено, что нейрогенные механизмы играют ключевую роль в развитии нарушений ритма сердца у мышей и крыс, вызванных эндотелином, введенным внутривенно на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME. Впервые доказано, что адекватная модель глобальной ишемии головного мозга у бодрствующих крыс SHR-SP в отличие от нормотензивных крыс может быть создана путем билатеральной окклюзии сонных артерий. Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая количественно изучать процессы фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле у наркотизированных крыс путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях. Обнаружено, что у крыс SHR-SP в ответ на стрессорное воздействие вместо гипертензивной реакции, наблюдаемой у нормотензивных крыс, развивается гипотензия, что свидетельствует о нарушении механизмов адаптации при артериальной гипертонии. Антидепрессанты дезипрамин и тетриндол у крыс SHR-SP по-разному влияют на сердечно-сосудистую систему, хотя и вызывают одинаковые седативные эффекты. Установлено, что одной из причин патологически высокого АД у крыс SHR-SP являются изменения во взаимодействии эндотелина и оксида азота.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные углубляют и дополняют представления о методических подходах, которые следует использовать при разработке и оценке адекватности in vivo моделей для изучения сердечно-сосудистой системы. Разработанные и изученные на уровне целого организма экспериментальные модели перспективны для исследования физиологических механизмов развития артериальной гипертонии, нарушения ритма сердца, глобальной ишемии головного мозга, а также для их фармакологической коррекции. Разработана модель для количественной оценки процессов фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле, приемлемая для изучения механизмов развития отеков и исследования новых противоотечных препаратов. Полученные данные об изменениях в механизмах взаимодействия эндотелина и оксида азота у гипертензивных крыс, позволяют рассматривать их как важные патогенетические факторы артериальной гипертонии и создают основу для направленного поиска новых фармакологических препаратов, а также дополняют знания о физиологии парокринной системы эндотелиальных клеток кровеносных сосудов.

Результаты диссертационного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биологических испытаний Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и включены в руководство по доклиническому изучению фармакологических веществ Росздравнадзора РФ.



На защиту выносятся следующие положения диссертации:

1. Повышенный симпатический тонус сердца и сосудов, пониженая чувствительность барорефлекса, участие Y-хромосомы и митохондриальной ДНК в наследуемости высокого уровня АД, возможность фармакологической коррекции АД с помощью моксонидина (гипотензивного препарата центрального действия) указывают на то, что крысы SHR-SP, имеющие АД диастолическое около 150 мм рт.ст. и систолическое около 200 мм рт.ст., являются адекватной экспериментальной моделью для изучения физиологических механизмов и поиска средств коррекции артериальной гипертонии.

2. Показано, что у крыс и мышей эндотелин, введенный внутривенно на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME, вызывает экстрасистолию и атриовентрикулярный блок. Ганглиоблокатор (гексаметоний), блокаторы парасимпатической (атропин) и симпатической (атенолол) нервной системы оказывают влияние на проявление аритмогенных свойств эндотелина, что свидетельствует о важной роли нервной системы в развитии этих нарушений ритма сердца.

3. Билатеральная окклюзия сонных артерий в течение 40-50 минут у бодрствующих крыс SHR-SP вызывает структурные нарушения митохондрий в дендритах пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа, сопровождается гипертензией и тахикардией, а также является причиной гибели животных, что свидетельствует об ишемии головного мозга и указывает на адекватность этой модели данному состоянию, в отличие от нормотензивных крыс, у которых для создания ишемии головного мозга требуется дополнительный отягощающий фактор - снижение АД до 50 мм рт.ст.

4. Доказано, что процессы фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле у наркотизированных крыс можно оценивать путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях. Показано, что данная модель может быть применена для изучения механизмов развития отеков и действия противоотечных препаратов.

5. Гипотензивная реакция, обнаруженная у крыс SHR-SP при стрессе, позволяет рекомендовать эту модель для исследования нарушений механизмов адаптации сердечно-сосудистой системы на стрессорное воздействие.

6. Крысы SHR-SP как модель артериальной гипертонии могут быть использованы при исследовании антидепрессантов с целью выявления у них гемодинамических эффектов.

7. Показано, что эндотелин является важным регуляторным пептидом периферического и центрального действия, имеющий широкий спектр влияния на сердечно-сосудистую систему. Доказано, что важными патогенетическими факторами артериальной гипертонии у крыс SHR-SP являются изменения во взаимодействии эндотелина и оксида азота.



Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих конгрессов, симпозиумов и конференций: съезд Российского общества фармакологов, Москва, 1995; конференция “Современные аспекты артериальных гипертензий”, Санкт-Петербург, 1995; Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 1996; Annual World Assembly “ American college of angiology”, Barcelona, 1996; Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”, Москва, 1997, 1998, 1999, 2000; International Congress of Pathophysiology, Lahti, 1998; конференция “Механизмы функционирования висцеральных систем”, Санкт-Петербург, 1999, 2001; конференция «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2001; сonference “Laboratory animals in biomedical research”, Warsaw, 2001; конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2001; конференция «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2002; съезд токсикологов России, Москва, 2003; конференция «Клинические исследования лекарственных средств», Москва, 2003; отчетная конференция ФИБХ РАН, Пущино, 2004; конференция «Ломоносов-2004», Москва, 2004; конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2006; OECD/Russia Federation workshop on “Biosecurity of microbial resources - complementing innovation”, Moscow, 2006; заседание секции «Биомедицина» Ученого совета ИТЭБ РАН, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 печатных работы, из них 28 статей в журналах, 2 статьи в коллективной монографии, 1 руководство и 21 работа в материалах конгрессов, симпозиумов и конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 61 рисунок. Она состоит из введения, описания методов исследования, 5 глав собственных исследований, выводов, библиографического списка, включающего 234 источника, из них 152 иностранных.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
Регистрацию АД осуществляли прямым методом. Животным имплантировали катетеры в брюшную аорту через бедренную артерию или в грудную аорту через левую сонную артерию. Во время измерения АД свободный конец катетера подсоединяли к электроманометру, сигнал от которого обрабатывали с помощью компьютерной программы, позволяющей измерять систолическое, диастолическое, среднее АД и частоту сердечных сокращений (ЧСС). При использовании радиотелеметрической технологии регистрации параметров крысам имплантировали устройство для мониторирования АД, ЧСС и двигательной активности (TA11PA-C40, Data Sciences Int., США). Это устройство состоит из атромбогенного катетера, заполненного специальным гелем, и капсулой, покрытой биосовместимым материалом. В капсуле находятся электоманометр, усилитель, радиопередатчик и аккумулятор. Катетер вживляли в брюшную аорту, капсулу закрепляли в брюшной полости. Животных использовали в экспериментах спустя 10-14 дней после операции, когда происходило полное восстановление нормальной циркадианной вариабельности изучаемых параметров. Во время эксперимента животное находилось в клетки и имело возможность свободного перемещения в ней, под клеткой размещали радиоприемник, который регистрировал параметры круглосуточно с интервалом 5-10 минут в течение нескольких недель.

Центральное венозное давление (ЦВД) измеряли в нижней полой вене на уровне диафрагмы. В нижнюю полую вену через бедренную вену вживляли катетер, состоящий из двух частей полиэтиленовой трубки РЕ-50 и силиконовой трубки такого же диаметра. Силиконовую трубку катетера вводили в сосуд. Для измерения ЦВД свободный конец катетера подсоединяли к электроманометру, сигнал от которого обрабатывали с помощью компьютерной программы.

Давление в левом желудочке сердца измеряли электроманометром, который был подсоединен к катетеру, имплантированному через правую сонную артерию в левый желудочек сердца. Обработку сигнала от электроманометра, осуществляли с помощью системы компьютерного анализа, рассчитывая следующие параметры: конечное диастолическое давление, максимальную скорость нарастания давления во время систолы, и максимальную скорость уменьшения давления во время диастолы.

Для измерения сердечного выброса и объемного кровотока в органах и тканях был использован метод с использованием меченых микросфер [Медведев с соавт., 1986]. Микросферы – это пластиковые шарики диаметром 15-30 мкм, меченные изотопами или красителями, вводили в левый желудочек сердца, где они перемешивались с кровью и выбрасывались сердцем с током крови в сосудистое русло. Вводили микросферы на фоне забора крови из брюшной аорты со строго постоянной скоростью. Сердечный выброс рассчитывали с помощью пропорции: количество введенных в сердце микросфер, количество микросфер в порции забранной крови и скорость забора крови. Микросферы при первом прохождении с током крови через органы и ткани застревали в мелких сосудах. По количеству застрявших в органах и тканях микросфер определяли объемный кровоток в них. Во время эксперимента у животного регистрировали также АД, что позволило рассчитать общее периферическое сосудистое сопротивление и сосудистое сопротивление в органах и тканях.

Для оценки состояния венозного тонуса было использовано среднее циркуляторное давление наполнения, которое определяли как ЦВД, измеренное в условиях временно на 4-5 секунд остановленного кровообращения. Остановку кровообращения вызывали раздуванием баллончика в правом предсердии. При остановке кровообращения кровь по градиенту давления из артериального русла переходила в венозные сосуды. ЦВД при этом возрастало до 5-8 мм рт.ст. и выходило на плато, а АД снижалось до 20-25 мм рт.ст. Величина среднего циркуляторного давления наполнения зависит от нескольких параметров: объема циркулирующей крови и емкостного сопротивления, которое определяется эластичностью и активностью гладкой мускулатуры вен. Если допустить, что эластичность вен и объем циркулирующей крови во время кратковременной остановки сердца не изменяются, можно полагать, что среднее циркуляторное давление наполнения определяется главным образом активностью гладкой мускулатуры и может быть использовано для оценки состояния венозного тонуса.

Уровень симпатических и парасимпатических влияний на сердце определяли по изменению ЧСС на фоне парасимпатической или симпатической фармакологической блокады атропином или атенололом, соответственно. ЧСС на фоне совместного введения атенолола и атропина, в условиях отсутствия симпатических и парасимпатических влияний, принимали за частоту водителя ритма, или интракардиальную ЧСС. Уровень симпатических влияний определяли как разность между ЧСС на фоне атропина и интракардиальной ЧСС, уровень парасимпатических влияний – как разность между ЧСС на фоне адренергической блокады и интракардиальной ЧСС. Кардиохронотропный компонент барорецепторного рефлекса определяли как ответы ЧСС на искусственное изменение АД при внутривенном введении вазодилататора нитропруссида и вазоконстриктора фенилэфрина.

Для исследования структурного компонента сопротивления сосудистого русла и периферической адренореактивности использовали метод перфузии в режиме постоянной скорости изолированного сосудистого бассейна задних конечностей раствором Тироде, регистрируя при этом перфузионное давление. Первоначальную скорость перфузии устанавливали на уровне 10 мл/мин/100 г массы ткани. Затем скорость перфузии повышали ступенчато, каждая ступень составляла 10 мл/мин на 100 г массы ткани. По окончании эксперимента устанавливали зависимость перфузионного давления от скорости перфузии. Сосудистое сопротивление определяли как перфузионное давление при первоначальной скорости перфузии в условиях максимальной вазодилатации. Жесткость сосудистой стенки измеряли как угол наклона прямой расход-давление.

Периферическую адренореактивность изучали по констрикторным реакциям сосудистого русла задних конечностей на возрастающие концентрации норадреналина в перфузионном растворе. Определяли концентрации норадреналина, вызывающие максимальную сократительную реакцию и ЕD-50.

Нами был разработан оригинальный метод для количественной оценки процессов фильтрации и реабсорбции жидкости в микрососудистом русле у крыс. Количественную оценку процессов фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном русле проводили путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях (ортостазе и антиортостазе) у наркотизированных крыс. До настоящего времени данный метод применялся только на крупных животных. Плотность крови измеряли с помощью денситометра, состоящего из 2-х модулей “DMA 602” и модуля “DMA 60” (“Anton Paar”, Австрия). Кровь через измерительные ячейки денситометров прокачивали со скоростью 0,8-1,0 мл/мин. Животным имплантировали три катетера: один для забора артериальной крови - в брюшную аорту через левую сонную артерию, второй для забора венозной крови - в каудальный отдел нижней полой вены через поясничную вену, третий для возврата крови - в яремную вену.
КРЫСЫ SHR-SP КАК МОДЕЛЬ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ
Сравнительный анализ параметров сердечно-сосудистой системы у крыс WKY и SHR-SP. Крысы WKY и SHR-SP были получены из Эдинбургского университета в 1996 году, и с этого времени их успешно разводят в Филиале ИБХ РАН путем инбредного скрещивания. В настоящее время получено более 20 поколений этих линий, поэтому можно полагать, что имеют место быть особые сублинии, именно они и были нами изучены. При изложении экспериментального материала используемые в наших исследованиях сублинии называются как исходные линии - крысы WKY и SHR-SP.

С помощью катетерной технологии регистрации параметров было показано, что систолическое, диастолическое и среднее АД у крыс SHR-SP было выше, чем у крыс WKY как у самцов, так и у самок (табл.1). Обращает на себя внимание тот факт, что АД у самцов SHR-SP было выше, чем у самок. Тогда как у крыс WKY половых различий в уровне АД обнаружено не было.

Кроме этого, у крыс SHR-SP уровень ЧСС был также выше, чем у крыс WKY как у самцов, так и у самок. Следует также отметить, что значения ЧСС у самок были выше, чем у самцов как у крыс SHR-SP, так и у крыс WKY. Таким образом, нами было обнаружено, что у гипертензивных крыс имеются половые различия, как в уровне АД, так и ЧСС, тогда как у нормотензивных животных только в уровне ЧСС.

Таблица 1.

АД и ЧСС у бодрствующих крыс WKY и SHR-SP (катетерная технология регистрации параметров)

Параметры

WKY

SHR-SP

самцы (n=22)

cамки (n=23)

самцы (n=25)

cамки (n=19)

Систолическое АД, мм рт.ст.

135 + 4

136 + 5

251 + 3 *

226 + 6 * #

Диастолическое АД, мм рт.ст.

101 + 2

102 + 3

181 + 2 *

170 + 3 * #

Среднее АД,

мм рт.ст.



117 + 3

118 + 4

214 + 3 *

195 + 4 * #

ЧСС,

уд/мин


294 + 8

332 + 10 #

317 + 5 *

363 + 8 * #

Примечание: в данной таблице и во всех последующих данные представлены как средние арифметические значения в группе и стандартные ошибки средних арифметических (М + SEM), n – количество животных в группе,  - P<0.05 относительно WKY, # - P<0.05 относительно самцов.
Использование радиотелеметрической технологии регистрации позволило проследить динамику изменений гемодинамических параметров. Было показано, что в ночное время суток в период повышенной двигательной активности как у SHR-SP, так и WKY значения АД и ЧСС были выше, чем в дневные часы (табл.2). Были обнаружены более высокие значения АД и ЧСС у крыс SHR-SP по сравнению с крысами WKY. Однако животные этих линий не отличались друг от друга по амплитуде изменений гемодинамических параметров между дневным и ночным периодами. По двигательной активности животные этих линий также не различались как по абсолютному уровню, так и по амплитуде изменений между дневным и ночным периодами.

Таким образом, как с помощью катетерной технологии регистрации параметров, так и радиотелеметрической технологии у крыс SHR-SP был подтвержден основной патогенетический признак артериальной гипертонии – более высокий уровень АД. Кроме этого, было обнаружено, что крысы SHR-SP отличаются от WKY не только более высоким уровнем АД, но и ЧСС.


Таблица 2.

Средние значения за световой период гемодинамических параметров и двигательной активности у бодрствующих самцов крыс WKY и SHR-SP (радиотелеметрическая технология регистрации параметров)



Параметры

WKY (n=19)

SHR-SP (n=20)

«день»

«ночь»

раз-ность

«день»

«ночь»

раз-ность

Систолическое АД, мм рт.ст.

126 + 4

131 + 4#

5 + 1

204 + 3*

210 + 3*#

6 + 1

Диастолическое АД, мм рт.ст.

93 + 2

97 + 2#

4 + 1

151 + 3*

156 + 3*#

5 + 1

Среднее АД,

мм рт.ст.



109 + 3

114 + 3#

5 + 1

177 + 3*

183 + 3*#

6 + 1

ЧСС,

уд/мин


260 + 6

325 + 7#

65 + 3

279 + 2*

340 + 3*#

61 + 2

Двигательная активность,

отн. единицы



7 + 2

22 + 2 #

15 + 1

7 + 1

23 + 1 #

16 + 1

Примечание: * - P<0.05 относительно WKY, # - P<0.05 относительно группы “день”.
Известно, что уровень ЧСС определятся как собственной частотой водителя ритма сердца, так и соотношением симпатических и парасимпатических хронотропных влияний на него. У SHR-SP собственная частота водителя ритма сердца оказалась статистически значимо выше, чем у WKY (табл.3). Кроме этого, было обнаружено, что у гипертензивных крыс повышен симпатический кардиохронотропный тонус, тогда как парасимпатический тонус понижен в сравнении с нормотензивными животными. Эти данные позволяют заключить, что повышенный фоновый уровень ЧСС у SHR-SP может быть обусловлен как изменениями в регуляции со стороны вегетативной нервной системы – повышением симпатического кардиохронотропного тонуса и понижением парасимпатического тонуса, так и увеличением собственной частоты водителя ритма сердца.

Итак, повышенный уровень симпатических влияний на сердце у крыс SHR-SP, позволяет полагать, что и регуляция тонуса кровеносных сосудов также изменена у этих животных. В опытах с перфузией задних конечностей было обнаружено, что реактивность кровеносных сосудов к норадреналину у крыс SHR-SP выше, чем у WKY. Следует также отметить, что у гипертензивных крыс изменен структурный компонент сосудистого сопротивления. Как сосудистое сопротивление при максимальной вазодилатации, так и жесткость сосудистой стенки у крыс SHR-SP были выше, чем у WKY.

Таблица 3.

Собственная частота водителя ритма сердца, симпатический и парасимпатический кардиохронотропный тонус у бодрствующих самцов крыс WKY и SHR-SP



Параметры

WKY

(n=10)


SHR-SP (n=9)

Собственная частота водителя ритма сердца, уд/мин

281 + 3

300 + 2 *

Симпатический тонус,

величина тахикардии в уд/мин



+34 + 4

+47 + 4 *

Парасимпатический тонус,

величина брадикардии в уд/мин



-61 + 4

-43 + 3 *

Примечание: * - P<0.05 относительно WKY.
Итак, в опытах с применением перфузии сосудистого русла задних конечностей крыс были обнаружены изменения у SHR-SP по сравнению с WKY в реактивности кровеносных сосудов к норадреналину и в структурном компоненте сосудистого сопротивления. Эти данные позволяют полагать, что и у бодрствующих гипертензивных крыс по сравнению с нормотензивными животными будут различия в ответах на симпатические стимулы, например, на стимуляцию адренорецепторов фенилэфрином.

У WKY на внутривенное введение фенилэфрина АД резко в течение 6 секунд увеличивалось на 37+4 мм рт.ст., затем также стремительно в течение 4 секунд снижалось. У SHR-SP же оно поднималось только на 25+3 мм рт.ст., затем гипертензия держалась на этом уровне в течение 8 секунд, и только потом АД снижалось. Такие различия в реакции на стимуляцию адренорецепторов у гипертензивных крыс по сравнению с нормотензивными животными могут быть обусловлены как изменениями реактивности кровеносных сосудов к симпатическим стимулам, так и их структурными перестройками.

Измененные реакции на экзогенные стимулы симпатомиметиков у крыс SHR-SP свидетельствует о перестройке в организме эндогенных регуляторных механизмов в условиях повышенного уровня АД. Одним из важных таких механизмов является барорефлекс. У крыс SHR-SP обнаружили снижение чувствительности барорефлекса и уменьшение общей амплитуды рефлекторного ответа ЧСС по сравнению с WKY.

Анализ параметров сердечно-сосудистой системы крыс SHR-SP и WKY показал, что крысы SHR-SP отличаются от крыс WKY не только патологически высоким уровнем АД, но и рядом других изменений характерных для артериальной гипертонии таких как, более высокий уровень ЧСС, повышенный симпатический кардиохронотропный тонус, увеличенная реактивность кровеносных сосудов к норадреналину, повышенная собственная частота водителя ритма сердца, увеличенное сосудистое сопротивление, пониженная чувствительность барорефлекса, пониженный парасимпатический кардиохронотропный тонус. Эти характеристики, обнаруженные у крыс SHR-SP, свидетельствуют о высокой степени их соответствия изменениям, наблюдаемым при развитии гипертонии у человека.



Изучение вопросов наследования гипертензии при скрещивании крыс SHR-SP и WKY. В клинической практике придается большое значение наследственной отягощенности для заболевания артериальной гипертонией. Считается, что в наследовании данного заболевания могут принимать участие некоторые локусы на аутосомах и Y-хромосоме. Кроме этого, в настоящее время обсуждается также вопрос о роли митохондриальной ДНК в наследовании артериальной гипертонии.

Для изучения вопросов наследования гипертензии был проведен сравнительный анализ параметров сердечно-сосудистой системы у крыс SHR-SP, WKY и их гибридов первого поколения от реципрокных скрещиваний. F1 гибриды при скрещивании самки WKY с самцом SHR-SP были названы «Ys», а F1 гибриды при скрещивании самки SHR-SP с самцом WKY - «Yw». Схема скрещивания представлена на рис.1.




Рис.1. Схема получения гибридов первого поколения от реципрокных скрещиваний между крысами SHR-SP и WKY.

Примечание: Xw - Х хромосома от WKY, Yw - Y хромосома от WKY, xs - Х хромосома от SHR-SP, ys - Y хромосома от SHR-SP, светлые прямоугольники – митохондриальная ДНК от WKY, заштрихованные прямоугольники – митохондриальная ДНК от SHR-SP.
Самки F1 гибридов были идентичны по половым хромосомам (Хwxs) и аутосомам и различались митохондриальной ДНК, которая наследуется, главным образом, по материнской линии. Митохондриальная ДНК у самок «Ys» от WKY, а у самок «Yw» от SHR-SP. Самцы гибридов гетерогенны в большей степени, чем самки, и одной из отличительных особенностей самцов «Ys» является то, что они наследовали Y хромосому от SHR-SP, а самцы «Yw» - от WKY.

У самок «Yw» АД статистически значимо выше, чем у самок «Ys» (табл.4). Отличительной особенностью самок «Yw» является то, что они наследовали митохондриальную ДНК от гипертензивных крыс, тогда как самки «Ys» - от нормотензивных животных. Таким образом, можно полагать, что митохондриальная ДНК принимает участие в наследовании гипертензии.

У самцов «Ys» было обнаружено более высокое АД, чем у самцов «Yw», несмотря на то, что они наследовали Х хромосому и митохондриальную ДНК от нормотензивных крыс, и только Y хромосому от гипертензивных животных. Этот факт указывает на то, что Y хромосома играет важную роль в наследовании гипертензии. Следует также подчеркнуть, что у самцов «Ys» и «Yw» АД выше, чем у самок, и что гибриды первого поколения от реципрокных скрещиваний между крысами SHR-SP и WKY по уровню АД занимают промежуточное положение между родительскими линиями.

Таблица 4.

АД и ЧСС у бодрствующих самок и самцов крыс F1 гибридов «Ys» и «Yw» (катетерная технология регистрации параметров)

Параметры

cамки

cамцы

«Yw» (n=10)

«Ys»

(n=11)


«Yw» (n=11)

«Ys»

(n=10)


Систолическое АД, мм рт.ст.

177 + 5

165 + 3 *

193 + 3 #

211 + 4 * #

Диастолическое АД, мм рт.ст.

135 + 4

121 + 3 *

144 + 3 #


157 + 4 * #

Среднее АД,

мм рт.ст.



155 + 4

143 + 4 *

168 + 3 #


182 + 4 * #

ЧСС, уд/мин


333 + 14

321 + 16

315 + 5

336 + 8

Примечание:  - P<0.05 относительно «Yw», # - P<0.05 относительно самок.
Полученные результаты исследований вопросов наследования гипертензии свидетельствуют о том, что при скрещивании крыс SHR-SP и WKY наблюдаются сходные с человеком проявления наследственных детерминант. Показано, что Y хромосома и митохондриальная ДНК принимают участие в наследовании повышенного уровня АД. Обнаруженными нами закономерности наследования высокого АД могут служить основой для соответствующих клинико-эпидемиологических исследований, для расширения контингента людей, входящих в зону потенциального риска и требующих более пристального внимания.

Фармакологическая коррекция артериального давления у крыс SHR-SP с помощью гипотензивного препарата центрального действия моксонидина. Для круглосуточного мониторирования АД, ЧСС и двигательной активности крысам SHR-SP были имплантированы радиотелеметрические устройства (Data Sciences Int., США). Животные получали моксонидин ежедневно в течение двадцати дней зондом в желудок в двух дозах 2 мг/кг/сутки и 10 мг/кг/сутки. Контрольная группа крыс получала воду также зондом в желудок и в том же объеме (1 мл/кг/сутки).

Моксонидин в дозе 2 мг/кг/сутки вызывал снижение на 73% среднего АД с пятого дня ночью и днем, а также уменьшение на 51% ЧСС только в ночной период. Среднесуточные показатели среднего АД и ЧСС за весь период введения в группе животных, получавших моксонидин, составили 1771 мм рт.ст. и 3022 уд/мин, а животных контрольной группы - 1871 мм рт.ст. и 3172 уд/мин, соответственно. Двигательная активность у животных под действием малой дозы моксонидина не изменялась. После отмены препарата АД и ЧСС возвращались к исходным значениям.

Моксонидин в дозе 10 мг/кг/сутки снижал среднее АД на 235% ночью и на 185% днем по сравнению с контролем. Во время введения препарата дневные значения АД составляли 1452 мм рт.ст., ночные - 1402 мм рт.ст., и статистически значимо не отличались друг от друга. У животных контрольной группы АД было достоверно выше как днем (1782 мм рт.ст.), так и ночью (1841 мм рт.ст.) и имело циркадианную вариабельность. После отмены препарата гипотензия сохранялась. Снижение ЧСС при введении моксонидина отмечали только ночью на 143% относительно контроля, что вызывало нарушение циркадианного ритма. Средние показатели ночного и дневного уровня ЧСС у крыс, получавших препарат, составили 2882 уд/мин и 2833 уд/мин, тогда как у контрольных животных они были 3403 уд/мин и 2782 уд/мин, соответственно. В первый день после отмены препарата было обнаружено статистически значимое относительно контрольных животных повышение ЧСС, в последующие дни отмены введения препарата наблюдали восстановление циркадианного ритма ЧСС и абсолютные значения ЧСС были такими же, как и у контрольных животных. Моксонидин в дозе 10 мг/кг/сутки вызывал статистически значимое снижение двигательной активности только в ночное время, тем самым, нарушая циркадианный ритм. Двигательная активность контрольных животных в период бодрствования составляла в среднем 231 относительных единиц, у животных на фоне моксонидина - 152 относительных единиц. После отмены препарата циркадианный ритм двигательной активности восстанавливался до исходных значений.

Таким образом, было показано, что гипотензивный препарат центрального действия моксонидин вызывает у крыс SHR-SP дозозависимое снижение АД, а также уменьшение ЧСС. В большой дозе моксонидин проявлял седативный эффект сходный с таковым у человека, а также была обнаружена тахикардия после отмены препарата. Эти факты свидетельствуют о сходстве фармакологических эффектов у крыс SHR-SP и человека. Используя принцип подобия, можно заключить, что если известный фармакологический препарат вызывает у крыс SHR-SP сходные с человеком эффекты сердечно-сосудистой системы, то можно полагать, что новые фармакологические вещества, проявляющие гипотензивные эффекты на этой биомодели, будут также снижать АД и у человека.


НАРУШЕНИЕ РИТМА СЕРДЦА С ПОМОЩЬЮ ЭНДОТЕЛИНА И БЛОКАДЫ NO-СИНТАЗЫ У КРЫС И МЫШЕЙ
Были изучены аритмогенные свойства эндотелина (ЕТ-1) в условиях блокады NO-синтазы с помощью L-NAME у мышей NMRI, а также у крыс SHR-SP и WKY. Для измерения АД и ЧСС была использована катетерная технология, позволяющая определять период каждого сердечного сокращения (величина квантования сигнала была 512 гц). Животным вместе с катетерами вживляли также электроды для регистрации ЭКГ в грудном отведении. С помощью компьютеризированной установки проводили обработку ЭКГ, рассчитывали амплитуды зубцов и интервалы между ними. Количественную оценку нарушения ритма сердца проводили путем определения его вариабельности, рассчитывая среднее квадратичное отклонение для первых 1000 сердечных циклов сразу после введения веществ. Экстрасистолы были включены в расчеты, тем самым была оценена общая вариабельность ЧСС. Эксперименты выполняли на следующий день после операции на бодрствующих животных.

Исходные показания АД и ЧСС регистрировали в течение 15 минут. Затем животным контрольной группы вводили 0,9% раствор NaCl дважды с 10-ти минутным интервалом по 100 мкл/кг. Животным второй группы внутривенно вводили сначала 0,9% раствор NaCl и через 10 минут ЕТ-1 (1 нмоль/кг). Животным третьей и четвёртой групп через 10 минут после внутривенного введения L-NAME (2.5 мг/кг) вводили 0,9% раствор NaCl или ЕТ-1, соответственно. После введения ЕТ-1 параметры наблюдали в течение 15 минут.

ЕТ-1 увеличивал вариабельность сердечного ритма у мышей с 32+2 уд/мин до 51+5 уд/мин, у SHR-SP с 11+1 уд/мин до 31+2 уд/мин, у WKY с 13+1 уд/мин до 34+2 уд/мин. При блокаде синтеза оксида азота с помощью L-NAME наблюдалась лишь тенденция к увеличению вариабельности сердечного ритма. Аритмогенные свойства ЕТ-1 в условиях блокады NO-синтазы усиливались как у мышей (118+20 уд/мин), так и у WKY (61+5 уд/мин), но не у SHR-SP (30+3 уд/мин).


Рис. 2. Кривая АД после внутривенного введения ЕТ-1 (1 нмоль/кг) у бодрствующей мыши NMRI (стрелкой обозначена экстрасистола).
У животных, получавших ЕТ-1 на фоне блокады NO-синтазы, нормальный ритм ЧСС сменялся тахикардией, за которой могла следовать брадикардия, была обнаружена также экстрасистолия (рис.2). Регистрация ЭКГ у бодрствующих мышей сопровождалась методическими трудностями, которые не позволили однозначно интерпретировать полученные данные, поэтому была выполнена серия экспериментов на мышах, наркотизированных уретаном (1.5 г/кг, внутрибрюшинно).

У наркотизированных мышей аритмогенные свойства ЕТ-1 проявлялись только в условиях блокады NO-синтазы. Вариабельность ЧСС у животных этой группы была 58+15 уд/мин, что в 2 раза меньше, чем у бодрствующих животных. В условиях наркоза вариабельность ЧСС у контрольных животных была также уменьшена.



мВ

мВ

мм рт.ст.

мм рт.ст.

А

Б


В

Г





Рис. 3. ЭКГ (А, Б) и кривые АД (В, Г) после внутривенного введения ЕТ-1 (1нмоль/кг) на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME (2.5 мг/кг) у наркотизированной мыши NMRI (вертикальными стрелками показаны «дефектные» зубцы Р).
На рис.3 показаны ЭКГ и кривые АД наркотизированной мыши, получавшей ЕТ-1 на фоне блокады NO-синтазы. На ЭКГ видно, что одной из причин нарушения ритма может быть атриовентрикулярная блокада – зубец Р сформирован, однако, он оказался "дефектным", за ним не следовал комплекс QRS, (на рис.3 «дефективные» зубцы Р обозначены вертикальными стрелками). Такие "дефектные" зубцы Р появлялись с запаздыванием на 55 мсек, и их амплитуда была ниже по сравнению с контролем (0.08+0.01 мВ и 0.11+0.01 мВ, соответственно). За таким "дефектным" зубцом Р через 81+1 мсек следовал другой зубец Р, амплитуда которого была выше по сравнению с контролем и составляла 0.18+0.02 мВ. За этим зубцом Р уже формировался комплекс QRS, и электрическая активность завершалась сердечным сокращением. Такие изменения в ЭКГ наблюдались как при одиночных нарушениях ритма (рис.3, А и В), так и при переходе к брадикардии (рис.3, Б и Г).

Итак, было обнаружено, что ЕТ-1 способен вызывать нарушение ритма сердечных сокращений у бодрствующих мышей и крыс. Этот эффект усиливается в условиях блокады NO-синтазы с помощью L-NAME. Наркоз подавлял аритмогенные свойства ЕТ-1, однако, при введении L-NAME они вновь появлялись, хотя и в меньшей степени, чем у бодрствующих животных. Это позволяет предположить, что нейрогенные механизмы играют важную роль в реализации аритмогенных свойств ЕТ-1.

В связи с этим было выполнено еще три серии экспериментов, в которых изучали влияние нейромодуляторов (ганглиоблокатора - гексаметония и блокаторов парасимпатической и симпатической нервной системы - атропина и атенолола, соответственно) на аритмогенные эффекты ЕТ-1 в условиях блокады NO-синтазы. Эксперименты, посвященные изучению влияния нейромодумяторов, были организованы сходным образом, что и серия опытов, послужившая контролем, но в отличие от нее за 5 минут до первого введения мыши получали нейромодуляторы: гексаметоний (20 мг/кг), атропин (1 мг/кг) и атенолол (2 мг/кг).

Было обнаружено, что нейромодуляторы снижали вариабельность ЧСС сходным образом, как и наркоз. В условиях наркоза этот параметр составлял 20+1 уд/мин, при введении гексаметония - 18+1 уд/мин; атропина - 22+1 уд/мин; атенолола - 19+4 уд/мин, по сравнению с контролем 32+2 уд/мин. Было показано, что ганглиоблокатор гексаметоний полностью устранял аритмии, вызываемые ЕТ-1 на фоне блокады NО-синтазы.

В условиях совместной блокады м-холинорецепторов атропином и NО-синтазы с помощью L-NAME аритмогенные свойства ЕТ-1 проявлялись в меньшей степени, чем у животных, не получавших атропин (36+6 уд/мин и 118+20 уд/мин, соответственно). В процентах от собственного уровня исходных значений увеличение вариабельности ЧСС при введении ЕТ-1 в условиях совместной блокады холинорецепторов и NО-синтазы составило 95%, а на фоне блокады только NO-синтазы - 153%. Следует также отметить, что блокада NO-синтазы в отсутствии атропина приводила к увеличению вариабельности ЧСС на 28%, а при совместной блокаде холинорецепторов атропином и NО-синтазы изменения составляли всего 4%.

На фоне блокады адренорецепторов атенололом введение L-NAME повышало вариабельность ЧСС до 60+12 уд/мин. Аритмогенные свойства ЕТ-1 в условиях совместной блокады адренорецепторов и NО-синтазы полностью были подавлены. Вариабельность ЧСС у животных этой группы была 61+11 уд/мин и не отличалась от животных, которые получали только атенолол и L-NAME.

Итак, было показано, что аритмогенные свойства ЕТ-1, введенного внутривенно, проявлялись только у бодрствующих мышей и крыс, наркоз ингибировал эти эффекты пептида. Блокада синтеза эндогенного оксида азота увеличивала аритмогенные эффекты ЕТ-1 у бодрствующих мышей и крыс WKY, а также провоцировала их проявление у наркотизированных животных. Появление аритмогенных эффектов ET-1 у наркотизированных мышей на фоне блокады NO-синтазы может быть обусловлено как влиянием пептида на коронарные сосуды, вызывая их сужение, так и на клетки проводящей системы, на что указывают такие данные, как задержка появления Р зубца и уменьшение его амплитуды.

В опытах с применением ганглиоблокатора гексаметония было показано, что он снижал вариабельность сердечного ритма и полностью подавлял аритмогенные свойства ЕТ-1, наблюдаемые в условиях блокады NO-синтазы. Блокада парасимпатического отдела нервной системы с помощью атропина приводила к снижению вариабельности сердечного ритма у контрольных животных, получавших физиологических раствор. На фоне сочетанного введения атропина и L-NAME аритмогенные свойства ЕТ-1 были снижены относительно данного показателя в контроле. Известно, что усиление холинэргической иннервации ухудшает проводимость в предсердно-желудочковом узле, удлиняет его эффективный рефрактерный период и может привести к развитию атриовентрикулярного блока. В экспериментах на собаках Picker с соавторами [2001] показал, что блокада нейрональной NO-синтазы приводит к повышению вагусной активности. В наших экспериментах блокада NO-синтазы с помощью L-NAME также могла повышать активность вагуса, что в свою очередь могло приводить к увеличению вероятности возникновения атриовентрикулярного блока и нарушению ритма сердца. Введение атропина блокирует данное действие парасимпатической нервной системы и это приводило в наших экспериментах к отсутствию увеличения вариабельности сердечного ритма после введения L-NAME. Таким образом, атропин снижал аритмогенное действие ЕТ-1 главным образом за счёт устранения нейронального компонента последствий блокады NO-синтазы, а не собственно ЕТ-1.

Обратная ситуация наблюдалась при применении атенолола. Он снижал вариабельность сердечного ритма в контрольной группе животных, получавших физиологический раствор, однако, при введении L-NAME на фоне атенолола вариабельность сердечного ритма повышалась. Эти данные можно объяснить тем, что в условиях блокады адренорецепторов преобладает парасимпатический тонус, и блокада нейрональной NO-синтазы усиливает вагусные влияния на сердце. Следствием этого является увеличение вариабельности сердечного ритма. В пользу преимущественного влияния L-NAME на фоне атенолола именно на нейрональную NO-синтазу говорит и тот факт, что при этом практически не происходит увеличения АД. АД изменяется только на 4+1 мм рт.ст. при сочетанном введении препаратов, тогда как при использовании одного L-NAME АД повышается на 17+2 мм рт.ст. При введении ЕТ-1 на фоне сочетанного применения атенолола и L-NAME не наблюдается увеличения вариабельности ЧСС, что свидетельствует об отсутствии проявления аритмогенных свойств пептида. Можно предположить, что атенолол блокирует их, вероятнее всего, посредством своего коронарорасширяющего действия.

Таким образом, показано, что ЕТ-1, введенный на фоне блокады синтеза NO с помощью L-NAME, вызывает нарушение ритма сердца у бодрствующих крыс и мышей. Обнаружено также, что изменения соотношения симпатического и парасимпатического тонуса играют важную роль в проявлении аритмогенных свойств ЕТ-1. Причём, блокада парасимпатической нервной системы снижает эффекты ЕТ-1 главным образом за счёт устранения последствий подавления синтеза оксида азота. Тогда как блокада симпатической нервной системы подавляет собственные аритмогенные свойства ЕТ-1. Следует также подчеркнуть, что исследования по выявлению аритмогенных свойств новых фармакологических веществ, выполненные на наркотизированных животных, не могут в полной мере быть адекватными, так как в этих условиях может нарушаться взаимодействие регуляторных систем.


МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА КРЫСАХ SHR-SP
Хорошо известно, что глобальную ишемию головного мозга у крыс моделируют путем билатеральной окклюзии общих сонных артерий в сочетании с контролируемой гипотензией [Мирзоян с соавт., 2005]. Двухсторонняя перевязка общих сонных артерий вызывает морфологические изменения в нервных клетках головного мозга только в сочетании с понижением АД до 50 мм рт.ст. Искусственно созданная гипотензия, используемая как необходимый компонент при моделировании ишемии головного мозга, накладывает ряд ограничений на применимость данной биомодели и может извращать динамику и механизмы ответной реакции организма на ишемию.

Характерной особенностью крыс SHR-SP является то, что в возрасте 6-8 месяцев и старше у них наблюдаются нарушения мозговых сосудов, приводящие к спонтанным инсультам. Данная особенность этих животных позволила предположить возможность их использования для моделирования глобальной ишемии головного мозга путем окклюзии сонных артерий без дозированного снижения АД. В представленном исследовании была проверена эта гипотеза.

За сутки до эксперимента животным вживляли специальные окклюдеры на левую и правую сонные артерии, а также полиэтиленовый катетер в бедренную артерию для регистрации АД и ЧСС. Исходные показания АД и ЧСС регистрировали в течение 15-ти минут. Затем осуществляли окклюзию сонных артерий, продолжая регистрировать АД и ЧСС. Окклюзия сонных артерий продолжалась у крыс SHR-SP до появления у них судорог, у крыс WKY в течение 60-ти минут. По окончании эксперимента была изучена ультраструктура участков дендритов пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа.

На рис.4, приведены фотографии ультраструктуры участков дендритов пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа у крыс до и после билатеральной окклюзии сонных артерий. У контрольных животных SHR-SP (рис.4, А) и WKY (рис.4, В) не было обнаружено различий в структуре и размерах митохондрий. После билатеральной окклюзии наблюдали увеличение размеров митохондрий как у SHR-SP (рис.4, Б) так и WKY (рис.4, Г). Однако только у WKY после билатеральной окклюзии были обнаружены митохондрии, которые не отличались от митохондрий контрольных животных.

По площади поперечных срезов митохондрий в дендритах пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа контрольные крысы SHR-SP и WKY не отличалась друг от друга. Однако после билатеральной окклюзии сонных артерий площадь поперечных срезов митохондрий у SHR-SP была статистически значимо больше, чем у WKY.



Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал