Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям Специальность 020208. 65 Биохимия Красноярск сфу 2012 (07)



страница1/4
Дата05.05.2016
Размер0.9 Mb.
ТипУчебно-методическое пособие
  1   2   3   4
Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет




ЭНЗИМОЛОГИЯ
Учебно-методическое пособие

к лабораторным занятиям




Специальность 020208.65 – Биохимия

Красноярск

СФУ

2012


УДК 577.17(07)

ББК 28.072.534Я73



Составители: Н.М.Титова, Т.Н.Субботина

Энзимология : Лабораторный практикум /[Текст] / сост. Н.М. Титова, Т.Н. Субботина. – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 60 с.

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу «Энзимология» составлены в соответствии с программой курса и являются основным учебно-методическим руководством по проведению его лабораторного практикума.

В учебном пособии представлены подробные, четко структурированные работы по основным разделам курса «Энзимология» разной степени сложности. Предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов.

УДК 577.17(07)

ББК 28.072.534Я73
© Сибирский

федеральный

университет, 2012


РАБОЧАЯ ПРОГРАММА КУРСА «ЭНЗИМОЛОГИЯ»

Раздел 1. Структура и свойства ферментов

Катализ и катализаторы. Ферменты как особые представители катализаторов. Краткие исторические сведения о развитии энзимологии. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Новые пути практического использования ферментов. Иммобилизованные ферменты. Инженерная энзимология. Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Характеристика классов и важнейших групп ферментов. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов.



Методы регистрации ферментативной активности. Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы ферментов. Международная единица. Катал. Удельная активность, молекулярная активность, активность каталитического центра. Определение активности ферментов. Характеристика стационарных (по конечной точке) и кинетических методов определения активности ферментов. Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчёт ферментативной активности при определении активности по конечной точке и при кинетическом определении. Сопряженные реакции (с одним, двумя и более сопрягающими ферментами). Основные требования к сопряженным ферментативным реакциям. Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный, иммунохимический и др.

Уровни структурной организации ферментов. Принципы пространственной организации молекул ферментов, проблема сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию. Шапероны «белки теплового шока» – hsp (heat shock proteins) – специальные «машины» для фолдинга белков, осуществляющие этот процесс наиболее эффективно в условиях краудинга (crowding – толкучка, молекулярная теснота новосинтезированных полипептидных цепей) в живой клетке. Структура и роль шаперонов. Шаперонины. Посттрансляционные модификации.

Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов. Классификация доменов. Домены, обеспечивающие формирование активного центра. Домены, участвующие в регуляции ферментативной активности. Домены, обеспечивающие связывание ферментов с мембранами. Роль доменов в осуществлении аллостерической регуляции.

Бифункциональные ферменты: катализирующие реакции одного метаболического пути (аспартокиназа – гомосериндегидрогеназа); катализирующие противоположно направленные реакции (6-фосфофрукто-2-киназа-фруктозо-2,6-бисфосфатаза).


Кофакторы ферментов и их роль в катализе. Классификация кофакторов. Коферменты, простетические группы, ионы металлов. Коферменты окислительно-восстановительных реакций – NAD, NADP, FMN, FAD, железопорфирины, убихиноны, аскорбиновая кислота. Физико-химические свойства, взаимодействие с апобелками, биохимические функции. NAD(Р)-зивисимые дегидрогеназы (лактатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Флавиновые ферменты (сукцинатдегидрогеназа, липоамиддегидрогеназа). Каталаза, глутатионпероксидазы. Цитохромы класса a, b, c, d и др. Роль аскорбиновой кислоты в функционировании тирозиназы.

Коферменты – переносчики групп: нуклеозидфосфаты, фосфаты сахаров, HSCoA, пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота. Коферменты синтеза, изомеризации и расщепления связей: тиаминдифосфат, биотин, кобамидные коферменты. АТР-зависимые ферменты (гексокиназа, тиамин-пирофосфотрансфераза, нуклеотидилтрансферазы). Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты (аминотрансферазы, декарбоксилазы). Ферменты, использующие тетрагидрофолиевую кислоту для переноса одноуглеродных фрагментов (метил-, формил-, гидроксиметил-, метиле-, метенил- и формиминотрансферазы). Роль металлов в функционировании ферментов.



Топография активных центров простых и сложных ферментов. Активный центр ферментов. Якорный (субстратсвязывающий) и каталитический сайты активных центров. Активные центры простых и сложных ферментов. Методы определения аминокислот, входящих в активные центры ферментов. Химическая модификация, действие ингибиторов, квазисубстраты, алкилирование, блокирование SH-групп. Роль серина, гистидина, лизина, тирозина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот в активных центрах. Глицин, цистеин и пролин как структурообразующие аминокислоты.

Структура активных центров на примере лактатдегидрогеназы, химотрипсина, простагландин-Н-синтазы, карбоангидразы, триозофосфатизомеразы. Использование методов рентгеноструктурного анализа и сайт-специфического мутагенеза для изучения топографии активных центров. Ингибиторный анализ. Биоинформационный подход в изучении активных центров ферментов.


Раздел 2. Ферментативный катализ.

Факторы, определяющие эффективность действия ферментов. Сущность явления катализа. Гомогенный и гетерогенный катализ. Ферментсубстратный комплекс, стадии образования и распада, доказательства существования. Лимитирующие стадии ферментативных реакций. Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса (водородные связи, гидрофобные взаимодействия, координационные связи, электростатические взаимодействия, силы Ван-Дер-Ваальса).

Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа: эффект сближения и ориентации, напряжения и индуцированного соответствия, кислотно-основного и ковалентного катализа. Кислоты и основания в ферментативном катализе. Физико-химические механизмы катализа.



Карбоксипептидазы А – строение, свойства, механизм действия(2 часа)

Каталитические центры гидролаз. Деление гидролаза на четыре типа по строению активного центра и механизму действия. Карбоксипептизала А (КПА) – гидролаза, использующая комплекс Zn2+ для активации воды и субстрата. Образование активной формы фермента из прокарбоксипептизазы А. Субстраты фермента. Структура активного центра КПА: субстратсвязывающие и каталитические аминокислотные остатки. Работы У. Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия КПА. Глицилтирозин – «квазисубстрат» для КПА. Механизм действия лизоцима. Исследования Д. Филипса.

Экспериментальные подходы для выяснения механизма действия ферментов: кинетические исследования (вариации концентрации субстрата); модификация структуры субстрата; обратимое ингибирование; вариации рН; предстационарная кинетика (образование ES-комплексов, определение скоростей отдельных стадий реакции); сайт-специфический мутагенез.

Специфичность – уникальное свойство ферментов.

Специфичность – особая способность фермента осуществлять выбор субстрата данной структуры из большой совокупности близких по строению веществ. Концепция стерического соответствия «ключ-замок» (Э. Фишер). Концепция индуцированного соответствия (Д. Кошланд). Абсолютная специфичность действия (уреаза). Стереоспецифичность ферментов (D- L-стереоизомеры, цис- и транс-стереоизомеры). А- и В-классы NAD(P)-зависимых дегидрогеназ. Относительная иди групповая специфичность действия. Протеазы как пример ферментов с относительной специфичностью. Специфичность сериновые протеазы (трипсин, химотрипсин, эластаза).


Раздел 3. Регуляция активности и компатментализация ферментов

Ферменты в клетке и в организованных системах. Локализация ферментов в клетке. Понятие компартментализации на примере лизосомальных, митохондриальных ферментов.

Уровни организации ферментов. Протомеры (ферменты с третичной структурой) – гидролитические ферменты (пепсин, трипсин и др.). Олигомерные ферменты, состоящие из нескольких протомеров с одинаковыми или различными функциями; надмолекулярные комплексы: мультиферментные комплексы, мультиферментные конъюгаты; ферментные ансамбли: адсорбционные, интегральные.

Мультиферментные конъюгаты – комплекс синтазы жирных кислот,. КАД (CAD)-комплекс. Мультиферментные комплексы – пируватдегидрогеназный комплекс, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс. Метаболоны – мультиферментные ансамбли, фиксированные на мембранах и структурных элементах клетки. Гликолитический метаболон эритроцитов, принципы организации, регуляция внутри- и внеклеточными сигналами. Метаболон цикла лимонной кислоты.

Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов. Регуляция активности ферментов внутриклеточными сигналами. Изо-стерическая регуляция (регуляция доступностью субстрата, кофактора). Компартментализация субстратов и ферментов. Регуляция продуктом реакции.

Аллостерические механизмы регуляция. К- и V- классы аллостерических ферментов. Регуляция активности фосфофруктокиназы. Аллостерические механизмы регуляции пируватдегидрогеназного комплекса.

Регуляторные энзимопатии. Генетически обусловленные регуляторные энзимопатии. Нарушение регуляции фосфофруктокиназы цитратом.

Регуляция метаболических путей. Ретроингибирование – ингибирование анаболических путей их конечными продуктами. Исследования Жакоба и Моно. Типы ретроингибирования.



Ковалентная модификация ферментов и ее типы. Химическая модификация ферментов – быстрый механизм регуляции активности ферментов внешними сигналами. Типы химической модификации ферментов (фосфорилирование, аденилирование и уридилирование, ацетилирование, ADP-рибозилирование).

Аденилатциклаза, фосфолипаза С. Протеинкиназы, типы. Протеинкиназа А, регуляция активности сАМР. Протеинкиназа С, регуляция активности диацилглицеролом, фосфолипидами и ионами кальция. Обратимость процесса ковалентной модификации. Протеинфосфатазы.

Специфические рецепторы: серпентиновые и тирозинкиназные рецепторы. Рецепторы – ионные каналы. Каскадный механизм регуляции активности гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы гормонами.

Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий (присоединение или отщепление регуляторных субъединиц или белков-регуляторов). Регуляция активности аденилатциклазы, киназы гликогенфосфорилазы.

Образование ферментов из неактивных предшественников (проферментов, зимогенов). изменение ковалентной структуры фермента в результате расщепления одной или нескольких пептидных связей. Активация трипсина, химотрипсина, эластазы, карбоксипептидазы А, фосфолипизы А2 и пепсина.

Регуляция количества ферментов в клетке. Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации. Время полужизни различных ферментов. Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. ATP-зависимые протеазы прокариот. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов. Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26S протеосомы.
Раздел 4. Прикладное значение ферментов

Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Носители для иммобилизации: природные и синтетические. Методы иммобилизации: физические (адсорбция, включение в гель, микрокапсулы, липосомы, ферментные пленки), химические (ковалентное сшивание с носителем, сшивка би- или полифункциональными реагентами). Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине, биомониторинге окружающей среды.

Ферменты в медицине.

Три главных направления развития медицинской энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.



Энзимопатология. Врождённые (наследственные) энзимопатии. Классификация. Механизм возникновения наследственных энзимопатий. Метаболический блок обмена веществ. Приобретённые энзимопатии: пищевые и токсические. Клинические проявления энзимопатий. Энзимопатии с клиническими проявлениями. Относительно бессимптомные энзимопатии. Бессимптомные энзимопатии.

Энзимодиагностика. Органная специфичность в распределении ферментов. Секреторные, индикаторные и экскреторные ферменты. Функциональные и нефункциональные ферменты. Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости. Недостатки ферментативного анализа. Основные принципы дифференциальной диагностики при использовании ферментативных тестов. Ранняя диагностика острого инфаркта миокарда. Диагностическое значение снижения ферментативной активности. Неспецифическое физиологическое и патологическое повышение активности ферментативной активности. Стабильность ферментов при хранении.

Применение ферментов в качестве аналитических реагентов. Энзиматические методы определения метаболитов в биологических жидкостях: глюкозы (глюкозооксидаза), мочевины уреаза.

Характеристика ферментов, наиболее значимых в энзимодиагностике. Аминотрансферазы: аспартатаминотрансфераза (АсАт) и аланинаминотрансфераза (АлАт). Лактатдегидрогеназа. -Амилаза. Креатинкиназа. Щелочная и кислая фосфатазы. Холинэстераза. Липаза.  – Глутамилтрансфераза.

Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов. Заместительная терапия (введение отсутствующего фермента). Использование ферментов в качестве агентов, специфически разрушающих продукты обмена веществ в организме больного. Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов.



ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ

В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Работая в лаборатории, необходимо соблюдать меры предосторожности, придерживаясь следующих правил:
Общие сведения

• Запрещается входить в лабораторию в верхней одежде.

• Работа в биохимической лаборатории допускается только в специальном халате, так как вероятна возможность загрязнения, порчи одежды при попадании на нее едких реактивов.
Обращение с реактивами

• Все концентрированные кислоты и щелочи должны находиться в вытяжном шкафу.

• Все опыты с ядовитыми и неприятно пахнущими веществами проводить в вытяжном шкафу.

• Наливать или насыпать реактивы следует только над столом.

• Не следует оставлять открытыми банки с реактивами.

• Пролитые или рассыпанные реактивы нужно немедленно удалить со стола, вытерев стол тряпкой и обмыв водой.

• Пролитые концентрированные кислоты следует засыпать песком, затем собрать песок лопаткой. Облитое место необходимо облить раствором соды и вытереть тряпкой.

• При работе с органическими растворителями (спирты, эфиры, ацетон, бензин и др.) нельзя определять вещество по запаху, так как может произойти отравление их парами.

• Наполнение пипеток растворами органических растворителей, кислот, щелочей проводят только при помощи груши.

• Внимательно следить за тем, чтобы реактивы (особенно кислоты и щелочи) не попадали на лицо, руки и одежду.

• Не ходить по лаборатории с концентрированными кислотами, а наливать их только в определенном, отведенном для этого месте.

• Не загрязнять реактивы во время работы (не путать пробки от склянок, содержащих разные реактивы; избыток взятого реактива не выливать обратно в склянку; пользуясь пипеткой, набирать каждый реактив только предназначенной для этого пипеткой, ни в коем случае не путать их).

• В случае попадания на кожу концентрированной кислоты облитое место нужно промыть большим количеством воды, а затем разбавленным раствором соды. При попадании растворов щелочей на кожу пораженное место нужно обмыть сначала разбавленной кислотой, а потом водой.
Обращение с нагревательными приборами

• Перед тем как зажечь спиртовку – убедиться, что поблизости нет горючих жидкостей (спирт, эфир и др.).

• Зажигать спиртовку можно только спичкой.

• В пробирке можно нагревать только небольшое количество раствора, жидкость должна занимать не более 1/3 объема пробирки.

• Пробирку при нагревании нужно направить в сторону от себя и рядом находящихся людей.

• Нельзя наклоняться над спиртовкой. В начале пробирку с раствором нужно прогреть всю, а затем нагревать в нужном месте, не вынимая из пламени спиртовки.

• Нельзя нагревать пробирку долго в одном месте, так как жидкость быстро закипит и выплеснется из пробирки.

• Нагревать пробирку нужно ниже уровня жидкости в ней.

• При нагревании жидкости держать пробирку отверстием в сторону от сея и тех, кто находится рядом, не касаться пробиркой горящего фитиля, всегда соблюдать большую осторожность при нагревании, не допускать выплескивания жидкости (время от времени отводить пробирку от пламени, не нагревать ее в вертикальном положении), не приближать лицо к сосуду, в котором нагревается жидкость.

• После нагревания следует сразу затушить спиртовку, накрыв пламя колпачком.

• Работа с водяной баней осуществляется только под тягой.

• При неосторожной работе могут быть ожоги нагретой стеклянной посудой. При ожогах на обожженное место нужно положить ватку, смоченную раствором марганцевокислого калия.



Закончив работу, привести рабочее место в порядок.


  1. Разделы дисциплины и темы лабораторных работ




п/п


Разделы

дисциплины



Темы лабораторных работ, трудоемкость (часы)

1

Раздел 1.

Структура и свойства ферментов.



1.1.Выделение и очистка каталазы из пшеничных зародышей (4 ч.)

1.2. Влияние рН и температуры на активность каталазы (2 ч.)

1.3. Влияние концентрации пероксида водорода на активность каталазы (2 ч.)

1.4. Зависимость скорости реакции, катализируемой каталазой от количества ферментного белка (2 ч.)

1.5. Механизм действия аминотриазола на каталазу (2 ч.)


2

Раздел 2. Ферментативный катализ.

2.1. Природа субстрата и активность глутатион-S-трансферазы (2 ч.)

2.2. Специфичность действия малатдегидрогеназы (2 ч.)

2.3. Промежуточный контроль (2 ч.)


3

Раздел 3.

Регуляция активности и компартментализация ферментов.



3.1. Оценка активности мембраносвязанной и цитозольной форм глутатионпероксидазы (4 ч.)

3.2. Аллостерическая регуляция глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (4 ч.)

3.3. Денситометрический метод выявления локализации сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах (2 ч.)


4

Раздел 4.

Прикладное значение ферментов.



4.1 Определение активности трансфераз в сердечной мышце и печени крысы на биохимическом анализаторе Сапфир 400 (4 ч.)



Раздел 1. Структура и свойства ферментов
РАБОТА 1.1. Выделение и очистка каталазы из пшеничных зародышей

В настоящее время получение ферментов путем выделения их из биологических объектов является единственно реальным, несмотря на то, что уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов – рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома с, поскольку синтетическое получение ферментов является слишком сложным и дорогим.

Выделяют ферменты так же, как и другие белки. Тем не менее есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов – это экстракция глицерином для сохранения нативных свойств ферментов, метод ацетоновых порошков (осаждение и быстрое обезвоживание при температуре -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты), адсорбция с последующей элюцией с адсорбента, метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и изоэлектрофокусирование. Одной из модификаций адсорбционного метода является афинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. При изменении характера проявителя исследуемый фермент элюирует с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтажную (аффинная сорбция – элюция) схему выделения.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур (лизосом, митохондрий, ядер и др.), которые несут в своем составе индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности SH-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.). Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из них при повышенной температуре теряют свою активность.

Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в 1906 г. А. Д. Розенфельдом. О степени чистоты ферментного препарата судят по его биологической активности; если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным. Из 3709 включенных в список ферментов более 1500 выделено и очищено, третья часть их закристаллизована, у нескольких сотен выяснена первичная, а у нескольких десятков – третичная структура.

В исследовании конформации ферментов обязательным требованием является получение препарата высокой степени чистоты. Изучение литературных данных и общих рекомендаций по очистке ферментативных препаратов позволило разработать методику получения препарата каталазы из пшеничных зародышей, включающую приготовление экстракта, осаждение этанолом при концентрации 60% (для получения спиртоосажденного препарата с наибольшей удельной активностью), фракционирование сульфатом аммония при насыщении 60–80%, гель-фильтрация на сефадексе G-25 и G-100.


Выделение и очистка каталазы
Исследуемый материал: зародыши пшеницы

Реактивы: 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,4); 0,15 М фосфатно-цитратный буфер (рН 7,4); 90%-ный этанол; сульфат аммония; сефадекс G-25; сефадекс G-100; стандартные белки с молекулярной массой около 300 кДа, 200 кДа и 100 кДа.

Оборудование: пробирки, пипетки, рефрижераторная центрифуга, хроматографические колонки, колбы

Ход работы:Препарат каталазы получают в виде вытяжки из тонкоизмельченных пшеничных зародышей. Для этого 5 г зародышей пшеницы тщательно растирают в фарфоровой ступке пестиком до получения однородной массы. Измельченные зародыши заливают 20 мл 0,15 М фосфатным буфером (рН 7,4). Гомогенат центрифугируют при 2000 g (4ºС). В супернатанте определяют белок микробиуретовым методом (см. раздел 6) и активность каталазы.

На первой стадии очистки фермент осаждают 60% этанолом. Для этого к 10 мл супернатанта добавляют 20 мл 90% этанола. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,15 М фосфатно-цитратного буфера, рН 7,4. В экстракте определяют активность каталазы и содержание белка микробиуретовым методом (см. работу 5.4.2). Степень очистки фермента после этой процедуры становится равной 2,38.

Затем фермент освобождают от балластных белков добавлением к 20 мл экстракта 14 г сульфата аммония. После фракционирования осадок растворяют в 15 мл фосфатно-цитратного буфера. В экстракте определяют активность каталазы и содержание белка микробиуретовым методом (см. работу 6.4.2). Фракционирование сульфатом аммония в пределах насыщения 60–80% позволяет получить препарат каталазы с удельной активностью 55,9 ед./мг белка; степень очистки при этом возрастает в 8 раз по сравнению с удельной активностью каталазы в гомогенате.

Для освобождения ферментного раствора от низкомолекулярных примесей осуществляют гель-фильтрацию на сефадексе G-25. В фильтрате определяют активность каталазы и содержание белка спектрофотометрическим методом (см. раздел 5). Степень очистки возрастает в 1,65 раза, а удельная активность каталазы при этом составляет 92,1 ед./мг белка.

Затем осуществляют гель-фильтрацию на сефадексе G-100. Раствор белка, выходящий из колонки, собирают в несколько фракций по 1,0-1,5 мл и в них проводят определение белка спектрофотометрическим методом (см. работу 6.4.4) и активности каталазы. Наиболее активные фракции объединяют.

Удельная активность ферментного препарата каталазы, полученного по данной схеме, составляет 545,2 ед./мг белка, степень очистки – 78,46. Молекулярная масса каталазы зародышей пшеницы, определенная гель-хроматографическим методом на сефадексе G-100, составляет 250 ± 1,5 кДа.


Определение молекулярной массы каталазы

методом гель-фильтрации
В основе метода определения молекулярной массы белков с применением гель-фильтрации лежит следующий эмпирический факт. Установлено, что объемы элюирования различных белков с одинаковыми молекулярными массами на одной и той же колонке в идентичных условиях практически совпадают. Это позволяет определять молекулярную массу неизвестного белка, если колонка с гелем предварительно проградуирована (прокалибрована). Калибровка состоит в определении объемов элюирования нескольких чистых белков с известной молекулярной массой. Полученные данные наносят на график в виде зависимости логарифма молекулярной массы (ММ) от объема элюирования (Ve). Такие зависимости в пределах одного – полутора порядков по величине молекулярных масс имеют, как правило, линейный вид. В качестве примера, на рис. 1.1.1. приведен такой график для ряда белков.

Рисунок – 1.1.1. Логарифмическая зависимость объёма элюирования от молекулярной массы белков


Определение активности каталазы
Для определения активности каталазы используют один из предложенных методов.
1. Определение активности каталазы с помощью йодистого калия
Принцип метода основан на образовании комплекса неразрушенного пероксида водорода с йодистым калием.

Реактивы: 3%-ный раствор иодистого калия в 50%-ном ацетоне (50 мл 3%-ного раствора иодистого калия растворяют в 50 мл ацетона); 3%-ный раствор перекиси водорода.

Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы (10 мм)

Ход работы: К 0,1 мл исследуемой пробы приливают 10 мл 3%-ной перекиси водорода и 10 мл 3%-ного раствора иодистого калия в 50%-ном ацетоне. Раствор фотоколориметрируют на синем светофильтре с длиной волны 435-445 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность каталазы определяют по формуле:
, где
A – активность каталазы в пробе;

D – оптическая плотность исследуемой пробы;

0,02 – коэффициент перевода в условные единицы каталазы.
2. Определение активности каталазы

с помощью молибдата аммония
Принцип метода основан на способности пероксида водорода взаимодействовать с солями молибдена, образуя стойкий окрашенный комплекс.

Реактивы: 30 мМ трис-HCl буфер (рН 7,4); Н2О2; дистиллированная вода; 4%-ный раствор молибдата аммония.

Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы (5 мм).

Ход работы: В опыте используют холостую, контрольную и опытную пробы. В каждую пробу вносят по 1 мл трис-HCl буфера. Затем в холостую и опытную пробу добавляют по 2 мл пероксида водорода, а в контрольную – 2 мл дистиллированной воды. После этого в контрольную и опытную пробы доливают по 0,1 мл препарата каталазы и оставляют пробы при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением во все пробирки 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. После этого в холостую пробу приливают 0,1 мл препарата каталазы.

Интенсивность окраски в каждой пробе измеряют на ФЭКе при длине волны 410 нм против контрольной пробы. Активность каталазы рассчитывают по формуле:



А – активность мкмоль Н2О2/мин*г белка

Ех – изменение оптической плотности холостой пробы за 10 минут;

Ео – изменение оптической плотности опытной пробы за 10 минут;

Vрс – объём реакционной среды (по методике = 3,01 мл);

t – время регистрации оптической плотности, равное 10 минут;

К - коэффициент микромолярной экстинкции для Н2О2 при длине волны 400 нм, равный 22,210-3 мкМ-1см-1;

Vпр – объём пробы;

d – длина оптического пути кюветы (0,5 см).


РАБОТА 1.2. Влияние рН и температуры на активность каталазы (2 ч.)
Каталаза (КФ 1.11.1.6 пероксид водорода: пероксид водорода оксидоредуктаза) – двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и соединенной с ним простетической группы. Это хромопротеин с молекулярной массой около 240 кДа, состоит из 4-х субъединиц, имеющих по одной группе гема.

Каталазная активность в клетках животных сосредоточена в основном в пероксисомах, которые содержат также ферменты, образующие Н2О2: глюкозооксидазу, уратоксидазу и флавопротеиндегидрогеназу. Частично каталаза локализуется в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к Н2О2 и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация Н2О2 высока, каталаза, напротив, активно разрушает ее.

В эритроцитах, где активность каталазы максимальна, фермент находится в комплексе с NАDPН, который не является необходимым для проявления каталитической активности, но предотвращает инактивацию фермента.

Каталаза предотвращает накопление в клетке пероксида водорода, образуемого при аэробном окислении восстановленных флавопротеинов, который в присутствии двухвалентного железа может генерировать гидроксильный радикал, являющийся особо агрессивной активной формой кислорода.

Определение активности каталазы в этой работе осуществляли спектрофотометрическим методом.

Принцип метода каталаза катализирует разложение пероксида водорода по реакции:

2 Н2О2 → 2 Н2О + О2

О ходе реакции судят по изменению концентрации пероксида водорода в пробе спктрофотометрическим методом при длине волны 230 нм, максимуме поглощения Н2О2. В качестве источника фермента можно использовать гомогенаты тканей, клетки крови, биологические жидкости, субклеточные органеллы.
Реактивы:


  1. 1 М трис-НСl буфер, рН 8,0, содержащий 5 мМ ЭДТА. Для приготовления буферного раствора 12,1 г триса и 0,186 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

  2. 1 М фосфатный буфер, рН 7,0. Для его приготовления берут 14,13 г фосфата натрия двузамещенного, помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

  3. 10 мМ раствор пероксида водорода. Его готовят из концентрированного раствора пероксида водорода следующим образом: сначала готовят раствор пероксида водорода с разаедением 1:99. Затем в спектрофотометрическую кювету помещают 2,7 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,0, разбавленного дис т. водой в соотношении 1:9. Измеряют оптическую плотность ОД1 при длине волны 230 нм. Далее в кювету добавляют 0,3 мл разведенного раствора пероксида водорода и определяют оптическую плотность ОД2. Расчет концентрации приготовленного раствора пероксида водорода осуществляют по формуле:

С = 141 х (ОД2 – ОД1).

При необходимости раствор пероксида водорода разводят.

Оборудование: спектрофотометр Specol, набор автоматических пи петок, пробирки, мерные колбы, кварцевые кюветы.

Ход работы: Для определения активности каталазы готовят две пробы – контрольную и опытную в соответствии с таблицей.
Таблица 1.2.1. Содержание проб для определения активности каталазы


Компоненты инкубационной пробы

Контрольная проба,мл

Опытная проба,мл

1 М трис-НСl буфер с 5 мМ ЭДТА,

рН 5,0; 6,0; 7,0; 8,0



0,15

0,15

Н2О2

-

2,70

Н2О

2, 85

0,15

гемолизат

0,06

0,06

Реакцию запускают внесением в пробу, находящуюся в спектрофотометрической кювете с расстоянием между рабочими гранями 1,0 см, гемолизата. Содержимое кюветы перемешивают и определяют начальную оптическую плотность. За ходом реакции следят в течение 3 минут. Регистрацию оптической плотности проводят при комнатной температуре.

Влияние рН среды на активность каталазы исследуют во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов. Фракционирование эритроцитов осуществляют по разработанной на кафедре методике (см. 5.2). Определение активности каталазы проводят при вышеописанных условиях в 1М трис-HCl буфере при рН 5, 6, 7 и 8.

Изучение влияния температуры на активность каталазы проводят в гемолизатах, приготовленных из каждой фракции клеток, которые делят на пять равных частей. Каждую отобранную аликвоту гемолизата подвергают инкубации при определенной температуре в течение 10 мин. Затем пробы резко охлаждают и центрифугируют 20 мин при 1700 g. Обработанные таким способом гемолизаты добавляют в реакционную смесь в качестве источника фермента. Исследования проводят в температурном диапазоне 20°С – 60°С с шагом в 5°С.

Полученные результаты представляют в виде рН-зависимостей и графиков Аррениуса. Рассчитывают коэффициент Q10.
РАБОТА 1.3. Влияние концентрации пероксида водорода на активность каталазы (2 ч.)
Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата почти всегда выражается в виде кривой, близкой по форме к одно из ветвей равнобочной гиперболы. Таким образом, при низком содержании субстрата в системе наблюдается отчетливая зависимость между его концентрацией и скоростью реакции. При больших концентрациях субстрата подобное явление отсутствует. Постоянную скорость, наблюдаемую в реакции при избытке субстрата, полностью насыщающего фермент, называют максимальной скоростью энзиматической реакции. При очень высоких концентрациях субстрата может наблюдаться субстратное ингибирование, обусловленное образованием непродуктивного комплекса фермента с несколькими молекулами субстрата.

Изучение влияния концентрации пероксида водорода на скорость реакции, катализируемой каталазой проводят постоянной концентрации фермента (гемолизат, приготовленный из отмытых от плазмы упакованных эритроцитов, разведение 1:49) и варьируемых концентраций субстрата (Н2О2). В работе используют следующие концентрации пероксида водорода: 3%-ная, 0,6%; 0,3%; 0,15%; 0,06%; 0,03%; 0,015%. Для определения активности каталазы используют метод с молибдатом аммония. По результатам исследования строят график зависимости скорости реакции от концентрации пероксида водорода и делают выводы.



РАБОТА 1.4. Зависимость скорости реакции, катализируемой каталазой от количества ферментного белка (2 ч.)
Скорость энзиматической реакции зависит прежде всего от природы фермента, характеризующегося низкой или высокой активностью. При прочих равных условиях и при наличии избытка субстрата и кофакторов начальная скорость энзиматической реакции пропорциональна концентрации фермента: v = k [E], где kконстанта скорости, v – скорость, [E] – концентрация фермента. При графическом изображении получается прямая линия, если по оси абсцисс откладывать концентрацию фермента, а по оси ординат – соответствующую ей величину начальной скорости реакции.

Изучение влияния концентрации фермента на скорость реакции, катализируемой каталазой проводят постоянной концентрации субстрата (пероксида водорода) и варьируемых концентраций фермента (источник каталазы – гемолизат, приготовленный из отмытых от плазмы упакованных эритроцитов). В работе используют гемолизаты со следующими разведениями: 1:5; 1:9; 1:24; 1:49; 1:74; 1:100. Для определения активности каталазы используют метод с молибдатом аммония. По результатам исследования строят график зависимости скорости реакции от концентрации фермента и делают выводы.


РАБОТА 1.5. Механизм действия аминотриазола на каталазу (2 ч.)
Активность каталазы ингибируется различными веществами, включая ее природный субстрат, пероксид водорода (Н2О2), азидом натрия, уксусной кислотой, цианидами, тяжелыми металлами и 3-амино-1,2,4-триазолом (АТ). Аминотриазол является необратимым ингибитором реакции, катализируемой каталазой. В работе используют различные источники фермента: печень крысы, очищенный препарат каталазы из зародышей пшеницы (работа 1.1), кровь крысы (кролика).

Забор крови у крысы (кролика) и последующую ее обработку для получения эритроцитов проводят согласно описанию в разделе 5.1.2. Из отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов готовят гемолизат (эритроциты : дистиллированная вода, охлажденная до 00, разведение 1 : ). Приготовление гомогената печени (250 мг ткани + 5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия) см. в разделе 5.1.3. Содержание белка в препарате фермента из печени, зародышей пшеницы и гемолизате осуществляют микробиуретовым методом ( раздел 5.4.2). Инкубацию препарата фермента с АТ проводят в термостате при 370 С в течение часа при постоянном перемешивании для контакта инкубационной смеси с кислородом. Используя концентрации аминотриазола 20 мМ определить: 1) является ли АТ ингибитором для каталазы из различных источников; 2) степень ингибирования фермента; 3) в различных препаратах. Использовать спектрофотометрический метод (см. работу 1.2) для определения активности каталазы.



Каталог: files
files -> Вопросы сертификационного экзамена для врачей по специальности «лфк и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа составлена в соответствии с Требованиями к содержанию дополнительных профессиональных образовательных программ
files -> Рабочая программа дисциплины Лечебная физическая культура и массаж Направление подготовки 050100 Педагогическое образование
files -> Лечебная физкультура
files -> К рабочей программе дисциплины «Лечебная физкультура и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла Медицинская реабилитация для специальности 310501 «Лечебное дело» по специализации 310501 «Лечебное дело»
files -> Лекции (час) Семинары (час) Самост работа Всего баллов Модуль 1
files -> Влияние мобильного телефона на здоровье человека


Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница