Методические разработки к практическим занятиям по иммунологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов


Тема:Реакция антиген-антитело с участием комплемента: реакция бактериолиза, гемолиза, РСК. Цель занятия



Скачать 245.87 Kb.
страница3/6
Дата23.04.2016
Размер245.87 Kb.
ТипМетодические разработки
1   2   3   4   5   6
Тема:Реакция антиген-антитело с участием комплемента: реакция бактериолиза, гемолиза, РСК.

Цель занятия:Изучить механизм, методику постановки и практическое значение реакций бактериолиза, гемолиза, связывания комплемента.

Вопросы для обсуждения:

1. Лизины и реакция лизиса. Реакция бактериолиза.

2. Реакция гемолиза и ее практическое применение.

3. Реакция связывания комплемента. Практическое применение РСК для диагностики инфекционных заболеваний.



Самостоятельная работа студентов:

1. Освоить технику постановки РСК.

2. Постановка и учет РСК для серологической диагностики коклюша.

3. Определение бактериолитической активности сыворотки по демонстрационным чашкам.

4. Изучение демонстрационных препаратов.

5. Оформление и защита протокола.



Методические указания к самостоятельной работе

Вначале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую — физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляется рабочая доза комплемента.

После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 °С на 30 минут (горячее связывание). При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре — 4ºС на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.

Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза — четыре плюса (++++), неполная - три и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-).



Занятие № 11
Тема: Серологические реакции с меткой антигена или антител (РИФ, ИФМ).

Цель занятия:Ознакомить студентов с серологическими реакциями иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментного анализа (ИФА). Уметь поставить и произвести учет.
Вопросы для обсуждения:

  1. Виды серологических реакций.

  2. Реакции с участием меченых антигенов или антител.

  3. РИФ. Прямой и непрямой методы.

  4. Преимущества ИФА по сравнению с РИА (радиоиммунологический анализ).

  5. Какие ферменты используют в качестве метки в ИФА (РЭМА)?

  6. Расшифровать аббревиатуру слова «РЭМА»?

  7. Какие красители используют в реакции иммунофлюоресценции?

  8. Варианты постановки РИФ.

  9. Какие из серологических реакций отличаются: а) наиболее высокой чувствительностью, б) доступностью и простотой, в) универсальностью, г) экспресс – диагностикой?


Самостоятельная работа студентов:

  1. Составить схему постановки РИФ.

  2. Составить схему постановки ИФА.

  3. Промикроскопировать готовые препараты люминесцентной микроскопией.

  4. Оценка интенсивности окраски при ИФА визуально и с помощью спектрофотометра.


Методические указания к самостоятельной работе

Реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела (иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы) по своей чувствительности превосходят все серологические реакции.



Реакция иммунофлюоресценцииКунса (РИФ)Иммунофлюоресценция – это метод, основанный на использовании специфичности и чувствительности иммунологической реакции. В отличие от других методов маркировки постановка пробы и точная локализация иммунной реакции на поверхности клетки или ткани происходит довольно быстро. Один из компонентов иммунной реакции, как правило антитело, метится флюоресцирующим красителем (маркировка, конъюгирование). После возбуждения флюоресцирующего агента положение антигена становится доступным непосредственному наблюдению вследствие развития флюоресценции. Предложенный в 1941г. Кунсом, этот метод после многочисленных усовершенствований прочно вошел в лабораторную практику. Данный метод относится кэкспресс – диагностике.
Различают прямой и непрямой метод.
При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов. Недостатком прямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток против каждого изучаемого антигена. Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки – антиглобулиновой, содержащей антитела только против кроличьих глобулинов. Поскольку диагностические антисыворотки, полученные путем иммунизации кроликов, так же содержат кроличьи глобулины, они в качестве антигенов реагируют c флюоресцирующей антиглобулиновой сывороткой и, вместе с тем, в качестве антител соединяются со специфическими исследуемыми антигенами (микроорганизмов). При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, вызывая его свечение при люминесцентной микроскопии.

Этапы

  1. На предметном стекле готовят мазок из материала.

  2. Фиксируют эталоном и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой (содержит антитела против возбудителя – антигена).

  3. Помещают во влажную камеру и инкубируют при 370С в течение 15мин. (для образования комплекса антиген – антитело.

  4. Промывают изотоническим раствором хлорида натрия (для удаления не связавшихся с антигеном антител).

  5. На препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика. Выдерживают в течение 15мин при 370С.

  6. Препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия, высушивают и исследуют методом люминесцентной микроскопии.


Реакция энзим – меченых антител (РЭМА) или иммуноферментный анализ (ИФА). Английская аббревиатура «EZIZA» (enzrymelinkedimmunosorbentassoy).

Иммуноферментный анализ является современным, высокочувствительным методом. Результаты реакции могут учитываться как визуально, так и инструментально.



Принцип метода заключается в фиксации известного антигена или антитела на носителе с последующей обработкой его исследуемой сывороткой или исследуемым антигеном и выявлении комплекса антиген-антитело антивидовыми глобулинами, мечеными ферментом «щелочная фосфатаза» или «пероксидаза хрена».

Для фиксации антигена или антитела используют полиэтиленовые пробирки или полистироловые пластинки. Сенсибилизацию лунок панелей производят антигеном или антителом при + 40С в течение 14-16 часов или при 370С в течение 30 мин.

Схема постановки ИФА.


Титры

Ингредиенты

реакции


1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

К сыв

К буфер

Контр

Буферный раствор

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

-

0,05

-

Исследуемая сыворотка

0,05

0,05

0,05

0,05

0,5мл в дез. р-р

0,05

-

-

Конъюгат (антитело или антиген обрабатывают ферментом)
























Контакт в течение 1 часа при 370С. Затем 3-х кратное отмывание буферным раствором.




Субстрат

(5-аминосалициловая кислота +Н2О2)



0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

Учет результатов реакции

+

+

+

+

-

-

-

-


Этапы постановки ИФА

  1. Сенсибилизация полистироловых пластинок антигеном при +4ос в течение 14-16 часов или при 370 в течение 30 мин.

  2. Сенсибилизированные панели промывают от несвязавшегося белка забуферным физиологическим раствором с добавлением твин-20.

  3. 3-х кратно промывают панели физиологическим раствором.

  4. Высушивание панелей.

  5. Затем в лунки вносят по 0,05мл исследуемой сыворотки в разведении (от1: 4 до 1: 32), инкубируют в течение 18ч. при комнатной температуре.

  6. Лунки промывают забуферным физиологическим раствором (для удаления непрореагировавшегося сывороточного глобулина).

  7. Обрабатывают антииммуноглобулиновой сывороткой, меченой ферментом (пероксидаза хрена, кислая или щелочная фосфатаза или глюкооксидаза).

  8. Активность фермента измеряют колориметрическим путем при добавлении субстрата 5-аминосалициловая кислота + Н2О2.



Занятие № 12

Итоговое занятие 1-12.

1. Тестовый контроль.

2. Разбор типовых и ситуационных задач по серологической диагностике инфекционных болезней.
Занятие № 13
Тема:Особенности иммунного ответа при различных микробных и паразитарных инфекциях.

Цель занятия:Изучить факторы, способствующие развитию иммунного ответа при различных инфекционных процессах.

Вопросы для обсуждения:


  1. Лимфоцит – основная структурная и функциональная единица иммунной

системы.

2. Характеристика различных форм лимфоцитов.

3. Функции лимфоцитов.

4. Общая характеристика инфекционного процесса.

5. Возбудители, оказывающие патологическое действие на ткани

инфицированного организма.

6. Неспецифический (врожденный) иммунитет.

7. Специфический иммунитет при инфекциях.



Самостоятельная работа студентов:

1. Изучение поверхностной микрофлоры кожи: посев отпечатков кожи пальцев рук на МПА

2. Изучение микрофлоры полости рта: приготовление мазка из зубного налета и окраска по Граму.

3. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов.

4. Оформление и защита протокола.

Методические указания к самостоятельной работе

Макроорганизм имеет широкий спектр средств защиты своей целостности и поддержания гомеостаза. Однако для минимизации энергетических и пластических затрат макроорганизм для устранения конкретного антигена использует лишь наиболее эффективные механизмы и факторы защиты. Поэтому при воздействии различных по природе и свойствам антигенов иммунное реагирование макроорганизма имеет свои особенности.

Иммунная реакция макроорганизма в ответ на бактериальную инфекцию в значительной степени определяется факторами патогенности микроба и в первую очередь его способностью к токсинообразованию. Различают иммунитет антибактериальный - против структурных компонентов бактериальной клетки и антитоксический - против белковых токсинов.

Особенности иммунитета при бактериальных инфекциях. Основными факторами антибактериальной защиты являются антитела и фагоциты. Антитела эффективно инактивируют биологически активные молекулы бактериальной клетки (токсины, ферменты агрессии и др.), маркируют их, запускают антителозависимый бактериолиз и иммунный фагоцитоз. Фагоциты непосредственно осуществляют фагоцитоз, в том числе иммунный, антителозависимый бактериолиз и внеклеточный киллинг патогена при помощи ион-радикалов и ферментов. Важная роль в борьбе с грамположительными микробами принадлежит лизоциму, а с грамотрицательными - комплементу (альтернативный путь активации), кроме того, существенное значение имеют белки острой фазы (С-реактивный и маннозосвязывающий протеин).

Ряд бактерий, относящихся к факультативным внутриклеточным паразитам, отличается повышенной устойчивостью к действию комплемента, лизоцима и фагоцитов (незавершенный фагоцитоз). К их числу относятся микобактерии, йерсинии, бруцеллы, сальмонеллы и некоторые другие. В такой ситуации макроорганизмвынужден переключать нагрузку на клеточное звено иммунитета, что ведет к аллергизации организма по механизму ГЗТ. Особое значение приобретают активированные макрофаги и естественные киллеры, осуществляющие АЗКЦТ, а также γδТ-лимфоциты.

Напряженность специфического антибактериального иммунитета оценивают в серологических тестах по титру или динамике титра специфических антител, а также по состоянию клеточной иммунореактивности (например, по результатам кожно-аллергической пробы).

Особенности иммунитета при протозойных инвазиях.

Паразитарная инвазия сопровождается формированием в макроорганизме гуморального и клеточного иммунитета. В крови определяются специфические антитела классов M и G, которые чаще всего не обладают протективным свойством. Однако они активируют АЗКЦТ с участием макрофагов, а в случае внутриклеточного паразитирования - естественных киллеров и T лимфоцитов. Паразитарные инвазии соспровождаютсяаллергизацией макроорганизма по механизму ГЗТ.


Характер противопаразитарного иммунитета определяется биологическими особенностями паразита. Многие паразиты обладают высокой антигенной изменчивостью, что позволяет им избегать действия факторов иммунитета. Например, каждой стадии развития малярийного плазмодия соответствуют свои специфические антигены.

Напряженность противопаразитарного иммунитета оценивается в серологических тестах по титру специфических антител и в кожно-аллергических пробах с протозойным антигеном.


Занятие № 14
Тема:Понятие об иммунологической толерантности. Трансплантационный иммунитет.

Цель занятия:Изучить механизмы иммунологической толерантности.
Вопросы для обсуждения:


  1. Иммунологическая толерантность, ее виды: центральная, периферическая и псевдотолерантность.

  2. История развития трансплантологии.

  3. Общая характеристика отторжения.

  4. Иммунные механизмы отторжения.

  5. Клинические проблемы трансплантации.

  6. Заготовка, методы консервирования и сроки хранения трансплантатов.


Самостоятельная работа студентов:

  1. Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов.

  2. Оформление и защита протокола.


Методические указания к самостоятельной работе

Новейшие достижения в области трансплантологии позволяют все шире использовать трансплантацию органов и тканей для лечения разных заболеваний. В последнее время наряду с трансплантацией костного мозга, почки, печени и сердца стали применять трансплантацию тонкой кишки, доли и сегментов печени, легкого, костей, поджелудочной железы и клеток панкреатических островков, а также других органов и тканей. Для трансплантации используются как трупные, так и полученные от живых доноров органы и ткани. Чаще донорами служат родственники реципиента. После трансплантации в организме реципиента развивается иммунный ответ на многочисленные антигены трансплантата. Исключение составляют случаи, когда донор и реципиент — однояйцовые близнецы. Наиболее изученные антигены человека, с которым связан иммунный ответ на трансплантат, — это антигены HLA (иногда их называют трансплантационными антигенами).



Механизмы трансплантационного иммунитета. Иммунный ответ на трансплантат обусловлен в первую очередь распознаванием антигенов HLA донора лимфоцитами реципиента. Это вызывает активацию T-хелперов, которые, в свою очередь, стимулируют пролиферацию B-лимфоцитов и цитотоксических T-лимфоцитов. Антитела к чужеродным антигенам HLA могут присутствовать в сыворотке реципиента и до трансплантации. Их выявление свидетельствует о предшествующей иммунизации антигенами HLA. Она возможна при переливании цельной крови и во время беременности. Выявление в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора свидетельствует о высоком риске сверхострого отторжения трансплантата. Оно обусловлено образованием комплексов, состоящих из антигенов трансплантата и антител реципиента, которые активируют свертывание крови и приводят к тромбозу сосудов трансплантата. Поскольку отторжение трансплантата вызывают чужеродные антигены HLA, лучший способ его профилактики — подбор донора, совместимого с реципиентом по антигенам HLA. Если реципиент уже иммунизирован антигенами HLA, донор должен быть полностью совместим с реципиентом.

Занятие № 15
Тема:Противоопухолевый иммунитет.

Цель занятия:Изучить механизмы противоопухолевого иммунитета.
Вопросы для обсуждения:

1. Иммунологический надзор и механизмы противоопухолевого

иммунитета.

2. Факторы, способствующие развитию злокачественных опухолей.

3. Характеристика злокачественных заболеваний.

Самостоятельная работа студентов:


  1. Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов.

  2. Оформление и защита протокола.


Методические указания к самостоятельной работе
Механизмы специфического противоопухолевого иммунитета. Очень опасным врагом иммунной системы являются раковые клетки. Рак начинается с мутации ДНК одной или нескольких клеток, что приводит к их бесконтрольному делению.

В нормальных клетках процесс деления жестко контролируется на всех уровнях. Поэтому для возникновения злокачественной опухоли обычно нужна не одна, а целая серия мутаций. Сначала опухоли растут очень медленно. Это значит, что перед иммунной системой стоит задача узнать буквально несколько десятков поврежденных клеток среди триллионов нормальных. Это то же самое, что определить террориста еще до того, как он начнет подготовку к террористическому акту. Тем не менее, ученые считают, что иммунная система справляется с этой задачей успешно и регулярно. Просто поразительной способностью опознавать и убивать раковые клетки обладают макрофаги и клетки-киллеры.

В начале 60-х годов известный австралийский учёный М.Бернет выдвинул концепцию иммунологического надзора, по которой иммунная система конкретного индивидуума срабатывает всегда, когда сталкивается с признаками генетически чужеродной информации. Иначе, иммунитет призван не только осуществлять антиинфекционную защиту, но главным образом обеспечивать генетическую целостность соматических клеток организма в течение его индивидуальной жизни. Среди прочих факторов, с которыми имеет дело иммунологический надзор, особое место занимает злокачественно перерождённые клетки.

Т-клетки. Среди всех иммунологических факторов, принимающих участие в защите организма от неоплазм (опухолей), главная роль принадлежит клеточной форме защиты. Наиболее активными клетками в разрушении опухоли являются CD8 Т-клетки, Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) или Т-киллеры и Т-хелперы. Если ЦТЛ выполняют прямую киллерскую функцию, то Т-хелперы способствуют её успешной реализации через секрецию цитокинов (интерферон-g, стимулирующий макрофаги и увеличивающий активность НК-клеток).

Активность ЦТЛ проявляется в результате распознавания комплекса – пептид опухолевого антигена+молекула 1 класса МНС (Главного комплекса гистологической совместимости). Механизм действия ЦТЛ на опухолевую клетку следующий: в т.н. «тёмных органеллах» внутри Т-киллера содержится белок–полимер перфорин, который в момент контакта ЦТЛ с клеткой–мишенью выбрасывается на поверхность оболочки клетки мишени, полимеризуется в присутствии ионов Са+, образуя поры-т.н. «перфориновые дыры». В результате, вода и соли через эти поры проходят легко, а белки задерживаются, осмотическое давление снаружи и внутри выравнивается и клетка гибнет.



В-клетки. Участие В-клеток в противоопухолевом иммунитете может проявлятся несколькими способами:

- разрушение опухолевых клеток антителами, фиксирующими комплемент;

- накопление НК-клеток, имеющих на своей поверхности цитофильные антитела;

Натуральные киллеры. Другим типом клеток, осуществляющих иммунологический надзор и участвующих в уничтожении трансформированных клеток, являются НК. Они относятся к лимфоидным клеткам, но при этом лишены маркеров Т- и В-лимфоцитов. Набор клеток, подвергающихся литическому действию НК, достаточно широк. Это — ряд вирусинфицированных и опухолевых клеток, клеток, на поверхности которых представлены цитофильные антитела, эмбриональные клетки. Несмотря на то что НК морфологически напоминают лимфоциты или лимфобласты, их гистогенетическая связь с Т- или В-лимфоцитами не установлена. Вероятно, НК относятся к самостоятельной линии дифференцировки, хотя на самых ранних этапах развития у них имеется общий с лимфоцитами предшественник. В отличие от лимфоцитов, НК не имеют антигенраспознающих рецепторов, не увеличиваются количественно после взаимодействия с чужеродным (например, вирусным) антигеном и не способны к формированию иммунологической памяти. При этом их активность повышается под влиянием цитокинов Т-клеток и в первую очередь интерлейкина-γ.

Макрофаги. В исследованиях установлено, что макрофаги, активированные цитокинами Т-клеток, оказывают определенное противоопухолевое действие. Оно может быть связано как с явлением прямого фагоцитоза опухолевых клеток, так и с процессом, опосредованным Фактором Некроза Опухоли.


Занятие № 16
Тема:Аллергические реакции. Механизмы и факторыВ и Т зависимых аллергий. Классификация аллергических реакций по Джеллу и Кумбсу.

Цель занятия: Изучить механизмы и факторы развития аллергических реакций, методы выявления.

Вопросы для обсуждения:


    1. Аллергия. Взаимоотношение аллергии и иммунитета. Основные понятия.

    2. Аллергены: классификация и свойства. Экзоаллергены и эндоаллергены. Аллергические и псевдоаллергические реакции. Аллергены, классификация. Виды неинфекционных и инфекционных аллергенов.

    3. Типы иммунологической гиперчувствительности по Gell&Coombs. Механизмы и факторы В- и Т-зависимых аллергий.

    4. Реагиновый тип аллергических реакций.

    5. Цитотоксический тип аллергических реакций.

    6. Иммунокомплексный тип (тип Артюса) аллергических реакций.

    7. Клеточно-опосредованный тип аллергических реакций.

Самостоятельная работа студентов:

  1. Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов.

  2. Оформление и защита протокола.


Методические указания к самостоятельной работе

Классификация аллергических реакций по Джеллу и Кумбсу.

(ГМ-КСФ — гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор)



Аллергия несомненно относится к иммунологическим феноменам. Здесь наблюдается воздействие антигена (аллергена), выработка антител и образование комплекса аллерген — антитело. Однако иммунитет проявляется обычно не в виде защиты организма от патогенных факторов, а в развитии повышенной чувствительности к этим антигенам.

Правда, сенсибилизация еще не есть аллергия. Однако ее сравнивают с пороховой бочкой, которая еще не взорвалась, но в любой момент может взорваться.

Принято считать, что взаимодействие антигена с антителами, которое способствует повышению сопротивляемости организма, и есть иммунитет. Но в том случае, когда такое взаимодействие вызывает болезнь,— это уже аллергия. В основе ее лежит иммунный ответ, протекающий с повреждением тканей. При этом срабатывают те же иммунологические реакции, которые были выработаны для защиты организма от генетически чужеродной информации.

Механизмы аллергии и иммунитета настолько близки, что в настоящее время аллергические реакции ускоренного и замедленного типа нередко обозначают как Т- и В-зависимые. К Т-зависимым аллергическим реакциям относятся: реакция отторжения трансплантата, замедленная аллергия к растворимым белкам, ряд аутоаллергических реакций, контактный аллергический дерматит. Т-зависимая аллергия играет важную роль при повышенной чувствительности к микробактериям туберкулеза, а также при некоторых других инфекциях (например, вирусных или вызванных патогенными грибками).

Замедленные аллергические реакции возникают преимущественно при помощи Т-активных клеток. При аллергических реакциях ускоренного типа появляющиеся агрессивные антитела наряду с блокадой аллергена бьют и по самому организму. Нередко именно избыточное накопление этих антител является непосредственной причиной гибели организма (например, от анафилактического шока). Для аллергической реакции не существует какого-либо специального механизма. Это тот же механизм иммунитета, только сопровождающийся клиническим проявлением аллергии. Поэтому и считается: аллергия — иммунитет наоборот.

Одним из широко известных, непосредственно относящимся к иммунопатологии является СПИД (синдром приобретенного иммунного дефицита).


Занятие № 17

Каталог: files -> chairs
chairs -> Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла Медицинская реабилитация для специальности 310501 «Лечебное дело» по специализации 310501 «Лечебное дело»
chairs -> Пояснительная записка 5 Цели и задачи освоения дисциплины
chairs -> 1. Цели и задачи освоения учебной дисциплины Цели и задачи изучения дисциплины
chairs -> Рабочая программа «факультетская терапия. Профессиональные болезни»
chairs -> Рабочая программа учебной дисциплины «нервные болезни, нейрохирургия и медицинская генетика»
chairs -> Рабочая программа по госпитальной терапии профессионального цикла для специальности 060101 лечебное дело
chairs -> Правила написания психического статуса. Основные методы терапии Студент должен уметь: диагностировать эти патологические состояния у больных
chairs -> Учебно-методическое пособие для врачей и студентов Махачкала 2006 Составители: Эседов Э. М. заведующий кафедрой госпитальной терапии №3 с курсом клинической иммунологии и аллергологии, д м. н., профессор


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница