Оценка информативности лабораторных показателей при хронической инфекции, вызванной вирусом эпштейна−барр 14. 03. 10 клиническая лабораторная диагностика 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология



Скачать 382.53 Kb.
Дата01.05.2016
Размер382.53 Kb.
ТипАвтореферат
На правах рукописи

Горейко

Татьяна Владимировна

ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА−БАРР

14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России



Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

КАЛИНИНА Наталия Михайловна

доктор биологических наук

Дрыгина Лариса Борисовна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

РАХМАНОВА Аза Гасановна

доктор медицинских наук профессор

СЕРЕБРЯНАЯ Наталия Борисовна


Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится «22» сентября 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан «___ » _________ 2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Инфицированность вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) регистрируется во всем мире и охватывает около 90% населения (Самарин Д.В., 2008; Carville A. et al., 2008; Sargsyan S.A. et al., 2010). Литературные данные последних лет свидетельствуют о патогенетической значимости ВЭБ не только для детей, но и для взрослых (Алексеев А.В., 2009; Бацков С.С., 2011). Наряду с известной ролью ВЭБ в качестве возбудителя инфекционного мононуклеоза (ИМ), лимфомы Беркитта и носоглоточной карциномы доказан его вклад в развитие аутоиммунной патологии и синдрома хронической усталости (Ершов Ф.И., 2006; Исаков В.А., 2006; Долгих Т.И., 2011).

Наиболее частым типичным и хорошо изученным еще в 70-е годы ХХ века проявлением первичной инфекции, вызванной ВЭБ (ИВЭБ), является ИМ, возникающий в 50% случаев при инфицировании в юношеском или во взрослом возрасте (Тимченко В.Н., 2001; Иванова В.В. и соавт., 2004; Самарин Д.В., 2008). В качестве единственных лабораторных критериев диагностики ИМ служили появление атипичных мононуклеаров в клиническом анализе крови и неспецифических гетерофильных антител в реакции Пауля-Буннеля (Straus S.E. et al.,1993).

Хроническая персистирующая инфекция, вызванная ВЭБ (ХИВЭБ), практически не исследована (Малашенкова И.К. и соавт., 2007; Павленко О.А. и соавт., 2009). Принято считать, что ХИВЭБ имеет выраженные клинические проявления только на фоне тяжелой депрессии иммунной системы, например, при иммуносупрессивной терапии, синдроме приобретенного иммунодефицита (Алексеев А.В., 2009). Однако в последние годы наметился рост клинических проявлений ХИВЭБ у пациентов без тяжелой иммунной патологии. Об этом свидетельствует увеличение уровня заболеваемости ХИВЭБ (Бошьян Р.Е., 2009). Подобная динамика определяется с одной стороны, развитием иммунодепрессии, обусловленной неблагоприятными факторами внешней и внутренней среды (Исаков В.А. и соавт., 2006; Ruan J.L. et al., 2004; Son S.W. et al., 2009), с другой стороны, появлением новых методов лабораторной диагностики ИВЭБ (Долгих Т.И., 2010; Siennicka J. et al., 2007). Несмотря на то, что настороженность врачей различного профиля в отношении ХИВЭБ повысилась, своевременная диагностика с дифференцировкой стадий вирусной инфекции проводится не всегда. Это связано с тем, что клинические проявления ИВЭБ могут варьировать в зависимости от состояния иммунной системы, сочетанного вирусного инфицирования и других причин.

Открытым остается вопрос о том, можно ли рассматривать персистенцию ВЭБ в макроорганизме как форму своеобразного симбиоза, или она связана с индукцией иммунодефицитного состояния, механизмы которого продолжают изучать до настоящего времени. Отечественными и зарубежными учеными получены данные о ведущей роли иммунных механизмов в патогенезе ИВЭБ (Исаков В.А., 2006; Petrova M. et al., 2006; Holmoy T., 2008; Gulley. M.L et al., 2008; Bieging K.T. et al., 2009). Согласно современным представлениям, при ИВЭБ меняются параметры клеточного и гуморального иммунитета, динамика которых изучена только при острой форме инфекции. Практически отсутствуют данные по изменению показателей иммунной системы при латентной ИВЭБ, реактивации ХИВЭБ у взрослых.

Несмотря на появление новых лабораторных технологий, применяемых для установления ИВЭБ, до сих пор нет определенности в отношении диагностической ценности многих из них (Siennicka J. et al., 2007). Методы иммуноферментного анализа (ИФА) и различные варианты иммуноблоттинга (ИБ), которые в настоящее время стали использоваться при серологическом исследовании, различаются по спектру определяемых антигенных белков ВЭБ. В настоящее время не накоплен достаточный отечественный опыт по применению ИБ в диагностике ИВЭБ и определении стадий течения инфекции.

Значительный рост атипичных форм ИВЭБ среди взрослого населения, разнонаправленность мнений о причинах их возникновения, ограниченность данных о взаимосвязи показателей гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа при ХИВЭБ, неопределенности при выборе метода выявления ВЭБ-инфекции и сложности при интерпретации результатов лабораторных исследований указывают на актуальность темы и служат основанием для проведения данного исследования.


Цель исследования: выявить особенности специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при хронической персистирующей инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр для совершенствования алгоритма клинико-лабораторной диагностики.
Задачи исследования:

  1. Определить диагностическую значимость выявления специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр у пациентов с хронической персистирующей инфекцией для установления стадии инфекционного процесса при использовании различных серологических методов.

  2. Охарактеризовать особенности Т-клеточного звена иммунной системы, цитокинового статуса у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

  3. Провести сравнительный анализ параметров гуморального и клеточного иммунного ответа при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

  4. Выявить частоту сочетанной инфицированности герпесвирусами и охарактеризовать особенности параметров клеточного иммунитета.

  5. Выделить группу наиболее информативных лабораторных показателей для диагностики хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.


Научная новизна. С использованием новых лабораторных технологий впервые охарактеризован специфический гуморальный иммунный ответ при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Проведено определение параметров иммунной системы в отдаленные сроки после первичного инфицирования вирусом Эпштейна-Барр.

Установлена взаимосвязь параметров клеточного и гуморального иммунитета при различных фазах хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Охарактеризованы спектры специфических антител к белкам вируса Эпштейна-Барр в соответствии со стадией инфекционного процесса различными методами.


Теоретическая и практическая значимость. Уточнен иммунопатогенез хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр. Описаны на новом методическом уровне атипичные стадии инфекции, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр. Охарактеризованы взаимоотношения вирус–хозяин при персистенции вируса Эпштейна-Барр.

На основании проведенного исследования выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей для повышения качества диагностики ХИВЭБ и прогнозирования возможных осложнений. Даны рекомендации для практикующих врачей о возможностях использования современного серологического метода иммуноблоттинга. Предложены алгоритмы выявления атипичных стадий течения инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.



Обоснована необходимость комплексного исследования параметров Т- и В-клеточного иммунитета для определения различных вариантов течения хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.
Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Хроническая инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр, характеризуется тремя фенотипическими профилями гуморального иммунного ответа: наличием антител класса G к белкам VCA+NA в 71% случаев; VCA+NA+EA – 10%; VCA – 7%.

  2. Метод иммуноблоттинга имеет более высокую диагностическую значимость при выявлении маркеров активации хронической ВЭБ-инфекции по сравнению с традиционными методами клинической лабораторной диагностики.

  3. Наибольшую диагностическую значимость при определении стадии иммунного ответа при хронической персистирующей ВЭБ-ассоциированной инфекции имеет определение количества клеток СD3+, клеток с киллерным потенциалом – CD3+CD8+, CD3-CD(16+56)+, клеток, экспрессирующих HLA DR, В-лимфоцитов, продукция in vivo и in vitro IFN-α и IFN-γ.


Личный вклад автора. Автором составлен дизайн исследования и проведен анализ результатов клинико-лабораторного обследования 345 больных с ХИВЭБ. Совместно со специалистами автор принимал участие в клиническом обследовании пациентов. В ходе выполнения работы проведен аналитический обзор современной отечественной и зарубежной литературы. Автором самостоятельно выполнены иммунохимические исследования, проведен статистический анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению» (25-26 февраля 2010 г., Москва); Всероссийском конгрессе «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (27 мая 2010 г., Москва); юбилейной 10-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященная 125-летию основания СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины – 2010» (22 апреля 2010 г., Санкт-Петербург); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (27-30 сентября 2010 г., Санкт-Петербург); 11-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины – 2011» (24 мая 2011 г., Санкт-Петербург); First European Joint Congress of EFCC and UEMS (13-16 October 2010, Lisbon, Portugal); 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (15-19 May 2011, Berlin, Germany).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 – публикации в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы содержит 121 наименование, из которых 62 отечественные и 59 зарубежные.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования

Для решения задач исследования была сформирована группа пациентов с ХИВЭБ из 345 человек, которые проходили обследование и лечение в клинике ВЦЭРМ с 2008 год по 2010 год. Возраст обследованных пациентов находился в диапазоне от 22 до 69 лет (средний возраст 39,0 лет ±11,7 лет). Женщины составляли 57% (n=197), мужчины − 43%  (n=148).

В работу не включались лица с наличием симптомов острой ИВЭБ и атипичных лимфоцитов в крови, а также лица, имеющие сопутствующие аутоиммунные заболевания, клинические проявления и наличие лабораторных маркеров ВИЧ 1 и 2 типов, вирусных гепатитов, онкологических заболеваний, психические расстройства, больные после химио- или лучевой терапии.

Критериями отбора пациентов в группу ХИВЭБ являлось наличие жалоб: быстрая утомляемость, общая слабость, эмоциональная лабильность, депрессивные состояния, бессонница, головная боль, ознобы, дискомфорт в горле, боли в мышцах. При клиническом обследовании обращали внимание на увеличение лимфатических узлов, субфебрилитет, гиперемию зева. У некоторых больных имело место увеличение печени и селезенки (табл. 1).


Таблица 1

Клинические проявления у пациентов с ХИВЭБ




Клинические проявления

Количество, абсолютное

Количество, %

Астеновегетативный синдром

345

100

Поражения лимфоглоточного кольца

231

67

Периферическая лимфоаденопатия

162

47

Артралгия, миалгия, невралгия

131

38

Субфебрилитет

107

31

Гепатолиенальный синдром

41

12

Данные клинического обследования пациентов свидетельствовали о полиморфном и неспецифичном характере клинических проявлений, тем не менее, клинические проявления были стойкими.

В условиях клинической лаборатории пациентам проводилось:


  • определение специфических антител к белкам ВЭБ, вируса простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ1/2), цитомегаловируса (ЦМВ) методом ИФА;

  • определение молекулярных особенностей белков ВЭБ методом ИБ;

  • общий анализ крови;

  • определение субпопуляционного состава лимфоцитов;

  • определение содержания, спонтанной и индуцированной продукции интерферонов альфа (IFN-α) и гамма (IFN-γ).

Для определения антител IgM к VCA p18, IgG к EBNA-1 p72 и EA p138 ВЭБ использовались коммерческие диагностические тест-системы «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-NA-IgG» и «ВектоВЭБ-EA-IgG» производства ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия, IgG к VCA ВЭБ – «ДС-ИФА-АНТИ-ВЭБ-VCA-G» (ООО НПО «Диагностические системы», Россия). С помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ВЭБ-VCA-G – АВИДНОСТЬ» (ООО «НПО «Диагностические системы»», Россия) определялся индекс авидности IgG-VCA.

При проведении ИБ использовалась тест-система «Anti-EBV-Profile 2 EUROLINE (IgG)», разработанная фирмой «EUROIMMUN», Германия. В сыворотке крови одновременно выявлялись антитела IgG к пяти белковым антигенам ВЭБ с различной молекулярной массой: VCA gp125 – нативный белок, VCA p19 – рекомбинантный белок, EBNA-1 – рекомбинантный, p22 – рекомбинантный белок, EA-D – рекомбинантный. Для выполнения процедур ИБ использовалась автоматизированная система ProfiBLOT 48 («TECAN Austria GmbH», Австрия). Результаты ИБ обрабатывались при помощи компьютерной программы EuroLineScun в полуколичественном выражении.

Антител IgM к белкам ВПГ 1/2 определялись методом ИФА на тест-системе «ВектоВПГ-IgM» (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия), IgM и IgG к ЦМВ и IgG к ВПГ 1/2 – иммунохемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 2000 («Siemens MSD», США).

Клинический анализ крови проводили с помощью гематологического анализатора Coulter LH500 («Beckman-Coulter», США).

Исследование клеточного звена иммунитета включало определение следующих субпопуляций лимфоцитов: CD3+ (Т-лимфоциты), CD3+СD(16+56)+ (Т-NK-клетки), CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (T-киллеры), CD4+CD8+ (дубль-позитивные Т-клетки), СD3−CD8+ (активированные NK-клетки), СD3−СD(16+56)+ (NK-клетки), CD19+ (В-лимфоциты), CD25+ (рецепторы к ИЛ-2), лимфоциты экспрессирующие HLADR, лимфоциты, экспрессирующие маркер готовности к апоптозу (CD95). Рассчитывался иммунорегуляторный индекс CD4/CD8. Иммунофенотипирование клеток периферической крови осуществляли в многоцветном анализе методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 («Beckman-Coulter», США).

Из параметров цитокинового звена иммунитета определялись содержание в сыворотке, спонтанная и индуцированная продукция IFN-α (ООО «Протеиновый контур», Россия) и IFN- (ООО «Цитокин», Россия) методом ИФА.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2007», «Statistica 6.0». Для проверки согласия с нормальным типом распределения использовали критерий Шапиро-Уилка W. Был использован метод описательной статистики с определением медианы показателей и интерквартильного размаха – [25; 75]. Для определения различий в двух группах использовали непараметрический U критерий Манна-Уитни. При сравнении нескольких групп проводился дисперсионный анализ Краскелла-Уоллиса и медианный тест, сравнение средних рангов для всех групп.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выявление специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр методом иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга
Для подтверждения этиологии ВЭБ в возникновении симптомов заболевания у обследованных пациентов с подозрением на ХИВЭБ были использованы серологические методы исследования.

На первом этапе работы проведено полуколичественное определение продукции специфических IgG к капсидным (VCA), нуклеарным (NA) и ранним (EA) белкам ВЭБ в сыворотке пациентов (n=345) методом ИФА.

Обследование пациентов с ХИВЭБ не выявило антител класса M к капсидному белку VCA, что позволило исключить острую ВЭБ-инфекцию.

Частота определения антител IgG к VCA, NA и EA ВЭБ у обследованных пациентов представлены на рис. 1.



* − различие с частотой выявления IgG к VCA и NA достоверно (р<0,001, Пирсон и хи-квадрат).
Рис.1. Частота выявления IgG к антигенам ВЭБ у пациентов с ХИВЭБ методом ИФА.
Показано, что у обследованных пациентов чаще выявлялись антитела класса G направленных к VCA и NA, чем к EA (p<0,001), что подтверждало наличие хронической ВЭБ-инфекции.

У обследованных пациентов антитела IgG к VCA выявлялись в 305 (88%) из 345 случае, а к NA ВЭБ – 320 (92%) из 345 пациентов с ХИВЭБ и были наиболее часто определяемыми серологическими маркерами.

Частота выявления IgG к раннему белку – EA, была достоверно ниже, чем IgG к NA и к VCA и составляла 10% (n=36).

Характеристика фенотипических профилей специфичекого гуморального иммунного ответа при ХИВЭБ представлена в табл. 2.


Таблица 2

Частота выявления различных профилей специфического гуморального ответа при ХИВЭБ



Профили антител к антигенам ВЭБ

Количество пациентов

Количество пациентов, %

VCA+NA

245

71%

VCA+NA+EA

36

10%

VCA

25

7%

NA

39

12%

Показано, что у пациентов с ХИВЭБ достоверно чаще выявлялось сочетание антител класса G к VCA и NA (p<0,001), что являлось отражением хронической персистенции вируса.

У 10% (n=36) пациентов были определены антитела к VCA, NA и EA. Появление в сыворотке антител класса G к этим белкам отражало активацию хронического процесса.

«Изолированное» выявление IgG к VCA регистрировалось в 7% случаев (n=25). Оценка стадии инфекционного процесса у этих пациентов не могла быть однозначной и требовала дополнительных диагностических подходов, позволяющих определять антитела к пептидам gp125, p22 и р19 VCA вируса.

В ходе исследования ни у одного из пациентов не было выявлено сочетание антител IgG к EA+VCA. Важно отметить, что данный профиль специфических антител ассоциирован с ВЭБ-связанными онкологическими заболеваниями (Gulley M.L. et al., 2008).

«Изолированное» выявление антител к NA в 12% можно интерпретировать как стадию перенесенного инфекционного процесса с «потерей» синтеза IgG к VCA (паст-инфекция) или элиминацию ВЭБ. Их определение имело ретроспективное значение.

Для установления или подтверждения инфекционного процесса с определением стадии жизненного цикла вируса у пациентов с наличием IgG к VCA при отсутствии IgG к NA был использован метод ИБ (n=25).

Среди пациентов с фенотипическим профилем специфического гуморального ответа VCA в 80% случаев выявлялись антитела IgG к VCA gp125 при соотношении gp125/p22>1, что свидетельствовало об обострении инфекции. Антитела IgG к VCA p19, маркера завершения обострения инфекционного процесса, были выявлены у 5 (20%) пациентов с ХИВЭБ.

Низкоавидные антитела IgG к VCA с индексом авидности меньше 60% были выявлены в 14% случаев (n=34) среди пациентов с профилем антител к VCA+NA, в 8% (n=3) с профилем антител к VCA+NA+EA. У пациентов с изолированным выявлением антител к VCA низкоавидные антитела не определялись. При использовании ИБ у всех пациентов с низким индексом авидности были обнаружены IgG к VCA р22 – маркеру давней ИВЭБ.

Для сравнения ИФА и ИБ из общей группы пациентов с ХИВЭБ методом случайно выборки были отобраны 80 человек (табл. 3).

Таблица 3

Сопоставимость методов ИФА и ИБ




Метод

Серологический

маркер


Спектр вирусных белков

Класс

антител


Результат

«+»

«–»

ИФА

EA

р138

IgG

10 (12%)

70 (88%)

ИБ

EA

EA-D

IgG

21 (26%)

59 (74%)

ИФА

VCA

p18

IgG

66 (83%)

14 (17%)

ИБ

VCA

gp 125

IgG

65 (81%)

15 (19%)

p19

IgG

66 (83%)

14 (17%)

p22

IgG

59 (74%)

21 (26%)

ИФА

EBNA-1

p72

IgG

65 (81%)

15 (19%)

ИБ

EBNA-1

p79

IgG

61 (76%)

19 (24%)

Технология ИБ позволила установить наличие антител класса G к ранним белкам ВЭБ – EA-D у 21 пациента (26%). Таким образом, было показано, что диагностическая ценность выявления антител к ранним белкам ВЭБ методом ИБ в два раза выше, чем методом ИФА.

Представленные в табл. 3 данные указывают на сопоставимость методов ИФА и ИБ по выявлению антител класса G к VCA (83%). Преимущество метода ИБ заключалось в возможности выявления антител к вирусному капсидному антигену gp125 – маркер обострения инфекции, и р22 – маркер давности инфекционного процесса.

Положительные результаты IgG к EBNA-1 в ИФА (81%) превалировали над результатами IgG к EBNA-1 в ИБ (76%), однако различия были не достоверные. Установленные вариации результатов ИФА и ИБ объяснялись различием используемых в исследовании рекомбинантных вирусных антигенов – p72 и p79 и давали возможность полагать, что антитела направленные к EBNA-1 p72 продуцируются чаще, чем к EBNA-1 p79.

Таким образом, показана дополнительная диагностическая значимость метода ИБ при выявлении у пациентов только IgG к VCA методом ИФА. Метод ИБ является более чувствительным при реактивации ХИВЭБ. Использование индекса авидности IgG к VCA для определения давности инфекционного процесса не всегда является надежным. Альтернативой данному тесту может быть определение антител IgG к р22 вирусного белка VCA методом ИБ.

Характеристика показателей клеточного иммунного ответа пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр
Для характеристики особенностей иммунного ответа при ХИВЭБ у 345 пациентов были проанализированы показатели иммунной системы.

Количество лейкоцитов в крови у более 80% пациентов с ХИВЭБ находилось в пределах референтного интервала. Абсолютный лимфоцитоз и моноцитоз наблюдался у 69 и 76 пациентов с ХИВЭБ, что составляло 20,3% и 22,0%, соответственно, от всей обследуемой группы.

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов представлены на рис. 2.

Рис. 2. Особенности параметров клеточного иммунитета у пациентов с ХИВЭБ.
У 26% обследованных пациентов было повышено абсолютное содержание клеток CD3+. При подсчете относительного содержания CD3+ лимфоцитов, увеличение количества отмечалось у 46,9% пациентов. Медиана и интерквартильный размах показателя в группе с ХИВЭБ составляли (76,0 [71,0; 79,0])%, что превышало значения установленного референтного интервала. Таким образом, при исследовании показателя относительного и абсолютного содержания CD3+ лимфоцитов у каждого четвертого пациента отмечалось повышение числа Т-клеток, преимущественно за счет Т-хелперов (Th).

37% пациентов характеризовалось снижением числа Т-киллеров. В связи с этим у 55,4% пациентов с ХИВЭБ отношение лимфоцитов CD4/CD8 увеличивалось. Медиана данного показателя составляла 1,8 [1,3; 2,4]. Наблюдалось увеличение доли CD3+CD4+ (Th) и снижения доли CD3+CD8+(T-киллеры) за счет миграции в очаг воспаления.

Имело место увеличение абсолютного содержания «дубль»-позитивных Т-клеток (CD4+CD8+) у 50% лиц с ХИВЭБ. Повышенное количество незрелых «дубль»-позитивных Т-клеток могло быть обусловлено значимой вирусной нагрузкой и свидетельствовало о наличии аутоиммунного компонента в характере иммунного реагирования, последнее подтверждалось увеличением числа пациентов с повышенным индексом соотношения CD4/CD8.

Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов в группе пациентов с ХИВЭБ также характеризовались тенденцией к уменьшению абсолютного и относительного содержания CD3+CD8+(T-киллеры) и CD3-CD(16+56)+ (NK-клетки). Снижение количества клеток с киллерной активностью в периферической крови свидетельствовало либо о недостаточности цитотоксической активности врожденного и адаптивного иммунного ответа, либо о миграции этих клеток в очаг воспаления, у одной трети пациентов с ХИВЭБ. При этом у 20% пациентов наблюдалось увеличение количества CD3+CD(16+56)+ клеток, так называемых TNK-клеток эффекторов, обладающих свойствами, как Т-лимфоцитов, так и NK-клеток и играющих регуляторную роль в воспалительных процессах, ограничивая интенсивность иммунного ответа, а также аутоагрессию (Ярилин А.А., 2010).

Увеличение количества клеток, экспрессирующих низкоаффинный рецептор к IL-2 – CD25 наблюдалось в 19,4% случаев, что указывало на активацию и пролиферацию клеток у 19,4% обследуемых пациентов.

При проведении корреляционного анализа была выявлена достоверная умеренная взаимосвязь абсолютного содержания клеток CD25+ c абсолютным содержанием клеток CD3+CD4+ (p<0,05; rτ=0,37). Связь абсолютного содержания клеток с CD25+ c клетками CD3+CD8+ была слабая – rτ=0,17. Выявленные достоверные положительные корреляции указывали на активацию преимущественно Th.

При анализе субпопуляций, экспрессирующих «поздние» маркеры активации, выявлено увеличение количества клеток CD95+ у 12% пациентов и увеличение клеток HLA DR+ у 9,2% пациентов.

Количество В-лимфоцитов было снижено у 27% обследованных пациентов, что отличало острую ВЭБ-инфекцию от хронической. Снижение числа В-лимфоцитов у одной третьи пациентов с ХИВЭБ можно объяснить следующими причинами. Во-первых, происходит дифференцировка в антигенспецифические плазматические клетки-продуценты специфических антител, во-вторых, процессы апоптоза В-лимфоцитов превалируют над пролиферацией, в-третьих, происходит накопление В-клеток в периферических органах иммунной системы – лимфоузлах, селезенке, лимфоидных скоплениях.

Характеристика цитокиновой системы включала оценку спонтанной, индуцированной продукций и содержания в сыворотке IFN-α и IFN-.

Медиана показателей содержания в сыворотке IFN-α и медиана спонтанной продукции in vitro имела низкие значения, что указывало на отсутствие адекватного противовирусного ответа как in vivo (уровень в сыворотке), так и in vitro (клетки не были преактивированы в организме хозяина имеющейся ИВЭБ). Низкий уровень индуцированной продукции IFN-α свидетельствовал о снижении функциональной способности клеток отвечать на антигенный стимул.

Анализ показателей IFN- выявил, что у 71% пациентов с ХИВЭБ спонтанная продукция IFN- и у 51% пациентов содержание в сыворотке IFN- превышали референтные значения, отражая высокую функциональную активность Th1. Наблюдалась положительная корреляция (р<0,05; rτ=0,35) содержания в сыворотке и спонтанной продукции IFN- и числом Т-киллеров, что свидетельствует об активации адаптивного иммунного ответа.

Таким образом, при обследовании пациентов с ХИВЭБ было установлено, что преобладал Th1 тип иммунного ответа, о чем свидетельствовали увеличение количества клеток CD3+CD4+ и высокая способность лейкоцитов к продукции IFN-. Вместе с тем, у пациентов с ХИВЭБ наблюдалось снижение количества клеток с киллерной активностью в периферической крови: CD3+CD8+ и CD3-CD(16+56)+.

Анализ показателей IFN-α выявил, что у всех пациентов с ХИВЭБ резкое снижение уровня сывороточного IFN-α сочеталось с существенным понижением индуцированной продукции IFN-α лейкоцитами, что указывало на депрессию этого звена иммунной защиты, а также являлось показанием для назначения терапии препаратами IFN-α.

Взаимосвязь показателей специфического гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр
На основании лабораторных данных пациенты с ХИВЭБ были разделены на группы.

Первую группу составили пациенты с хронической персистирующей инфекцией, вызванной ВЭБ (n=245), которые характеризовались наличием антител класса G к VCA и NA.

Вторую группу составили пациенты с реактивацией ХИВЭБ (n=20). У этих пациентов с помощью метода ИБ были определены антитела IgG к VCA gр125 и VCA р22.

Третью группу (n=39) составляли пациенты с паст-инфекцией, у которых были выявлены только IgG к NA.

Пациенты с реактивацией ХИВЭБ и наличием антител IgG к VCA, NA и EA составили четвертую группу (n=36).

При сравнении показателей клеточного иммунитета в четырех группах пациентов с ХИВЭБ, значения медиан относительного и абсолютного содержания моноцитов и лимфоцитов крови не имели достоверных различий. Пациенты второй группы, с обострением ХИВЭБ, характеризовались тенденцией к относительному лимфоцитозу, а значение медианы составило (38 [29; 46]) %.

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов представлены в табл. 4.

Таблица 4

Показатели клеточного звена иммунной системы

(медиана [нижний квартиль; верхний квартиль])



Показатель

1-я группа

(n=245)


2-я группа

(n=24)


3-я группа

(n=39)


4-я группа

(n=36)


Референтный интервал

CD3+, в мкл.

1500

[1210; 1756]



2060*

[1704; 2333]



1594

[1329; 1951]



1234

[1090;1654 ]



950÷1800

CD3+, %

77 [71; 82]

76[72; 78]

77 [73; 79]

75 [69; 79]

52÷76

CD3+CD(16+56)+ ,

в мкл.


73

[45; 162]



108

[58;166]


85

[62; 199]



59

[40; 141]



5÷200

CD3+CD(16+56)+ , %

4,3

[2,3; 8,2]



3,6

[2,5; 5,3]



3,9

[2,7; 6,9]



3,8

[1,4; 4,7]



0,1÷8,0

CD3+CD4+, в мкл.

902

[752; 1064]



1339

[693; 1577]



939

[878; 1039]



781

[714;1244 ]



570÷1100

CD3+CD4+, %

47

[39; 53]


47

[41; 51]


43

[41; 53]


48

[46; 51]


31÷46

CD3+CD8+

(T-киллеры), в мкл.



485

[383; 677]



682

[554; 832]



669

[437; 823]



356*

[300; 484]



450÷850

CD3+CD8+,%

25

[21; 31]


24

[23; 37]


26

[20; 35]


23

[18; 27]


23,0÷40,0

CD4+CD8+, в мкл.

17

[9; 33]


16

[9; 31]


12

[7; 24]


3*

[2; 18]


5÷18

CD4+CD8+, %

0,8

[0,5; 1,5]



0,7

[0,3; 2,3]



0,4

[0,4; 1,2]



0,2*

[0,1; 0,5]



0,1÷1,1


CD3-CD8+, в мкл.

81

[45; 110]



105

[67;135]


72

[48; 77]


75

[46;141]


18÷150

CD3-CD8+, %

4,2

[2,4; 6,6]



3,8

[2,4; 5,9]



2,7

[2,4; 3,9]



4,3

[2,8; 6,6]



1,5÷6,0

Соотношение D4/CD8

1,9 [1,3; 2,4]

2,0 [1,0; 2,2]

1,7 [1,2; 2,6]

2,2 [1,6; 2,9]

1,0÷1,7

CD3-(CD16+56)+,

в мкл.


171**

[115; 303]



370

[228; 594]



289

[245; 329]



174**

[127; 255]



180÷420

CD3-CD(16+56)+, %

8**

[6; 14]


15

[12; 17]


14

[10; 18]


9**

[8; 14]


9÷19

*− значимое отличие от остальных групп (р<0,050; дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и медианный тест);

**− значимое отличие от 2-й и 3-й групп (р<0,050; непараметрический U критерий Манна-Уитни).
Наиболее многочисленная первая группа пациентов с ХИВЭБ, характеризовалась достоверным снижением относительного и абсолютного количества NK-клеток (CD3-CD16+56+), которые определяют эффективность противовирусного ответа.

У пациентов с обострением ХИВЭБ (вторая группа) отмечалось достоверное увеличение абсолютного числа CD3+ лимфоцитов, что связано, по всей вероятности, с активностью процессов пролиферации антигенспецифичных Т-клеток.

Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов с паст-инфекцией (третья группа) выявила, что исследуемые показатели не выходили за пределы референтных значений. Этот факт являлся подтверждением, что NA, стимулировал выработку специфических антител, являющихся диагностическими маркерами паст-инфекции.

Четвертая группа пациентов с реактивацией ХИВЭБ характеризовалась сниженным количеством в периферической крови Т-киллеров и NK-клеток, что указывало на подавление противовирусного ответа.

Анализ количества В-лимфоцитов, которым конституционно присуща экспрессия HLADR, выявил разницу более чем в 5% между количеством клеток HLADR+ и содержанием В-лимфоцитов во всех группах пациентов с ХИВЭБ. Можно предположить, что маркеры поздней активации HLADR экспрессировались Т-лимфоцитами, что указывало на активацию в Т-клеточном звене. В большей степени активация наблюдалась у пациентов с реактивацией ХИВЭБ (VCA+NA+EA).

Сравнительный анализ показателей продукции IFN-α (табл. 13) выявил, что содержание в сыворотке и спонтанная продукция имели достоверно сниженные значения в первой группе пациентов с ХИВЭБ. Выявленное достоверное снижение количества NK-клеток в периферической крови пациентов с хронической персистирующей инфекцией совместно с достоверно низкими показателями продукции IFN-α in vivo и in vitro указывает на низкую противовирусную активность клеток иммунной системы. При реактивации ХИВЭБ в четвертой группе пациентов эти показатели были достоверно выше, чем в остальных группах, но не превышали референтных интервалов. Это указывало на отсутствие адекватной активации клеток ВЭБ. Не обнаружено достоверных различий между величинами индуцированной продукции IFN-α у пациентов с различными фазами ХИВЭБ, а средние показатели не превышали нижнюю границу референтного интервала (табл. 5).


Таблица 5



Характеристика показателей системы интерферонов у пациентов с ХИВЭБ

(медиана [нижний квартиль; верхний квартиль])



Группа

IFN-α

IFN-

Содержание

в сыворотке

(0−50)

Продукция

Содержание

в сыворотке

(0−50)

Продукция

спонтанная

(0−50)

индуци-рованная

(100−500)

спонтанная

(30−50)

индуци-рованная

(1000−5000)

пг/мл

пг/мл

1-я

2*

[2;3]


2*

[2; 7]


90

[50; 148]



54

[31; 120]



66

[34;128]


534

[335; 956]



2-я

4

[3; 11]


2

[2; 11]


101

[56; 161]



58

[46; 106]



279* [201;382]

799

[760; 1041]



3-я

7

[8; 22]


7[2; 26]

84

[50; 159]



42

[27; 113]



143

[41;280]


554

[319; 974]



4-я

16*

[4; 32]


20*

[6; 50]


58

[26; 120]



57

[47; 302]



91

[57; 150]



703

[416; 1079]



*− значимое отличие от остальных групп (р<0,005; непараметрический U критерий Манна-Уитни)
Во второй группе пациентов с обострением ХИВЭБ выявлено достоверное увеличение спонтанной продукции IFN-, что сочеталось с увеличением числа T-клеток. В связи с длительностью вирусной инфекции клетки, продуцирующие IFN- к моменту обследования были функционально истощены, и при их исследовании in vitro отмечалось снижение индуцированной продукции у 75% пациентов. В других группах продолжался вялотекущий с низкой иммуногенной активностью процесс, отражением которого явилось достоверное увеличение спонтанной продукции IFN-, но не столь значительное, как во второй группе пациентов с ХИВЭБ, что характерно для хронической инфекции.

Выявлялась сильная взаимосвязь между относительным количеством клеток CD3+CD16+CD56+ и спонтанной продукцией IFN- у пациентов третьей группы, что позволило предположить, что именно TNK-клетки вносят вклад в увеличение продукции IFN- (rτ=0,87; р<0,05). Известно, что TNK-клетки выполняют регуляторную функцию, являясь основными продуцентами IFN-. Активация этих клеток свидетельствует о том, что при латентной вирусной инфекции (третья группа пациентов) снижение числа NK-клеток сопровождается подключением «резервного» звена противовирусной защиты.

В четвертой группе пациентов с ХИВЭБ определялась положительная корреляция между показателями продукции интерферонов и количеством клеток их продуцирующих. Выявленные статистически значимые корреляции отражали активацию моноцитов и клеток с киллерным потенциалом.
Влияние микстинфицирования герпесвирусами на показатели иммунного ответа
У пациентов с ХИВЭБ в 83% (n=286) были обнаружены антитела IgG к антигенам вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1/2) и цитомегаловируса (ЦМВ), что свидетельствовало о частой ассоциации вирусов семейства Herpesviridae.

Специфические антитела IgM к антигенам ЦМВ и ВПГ 1/2 выявлены не были, что позволило исключить активное течение вирусной инфекции у пациентов.

Сочетание антител класса IgG к ВЭБ и ВПГ 1/2 встречалось в 9%, сочетание антител класса IgG к ВЭБ и ЦМВ – 6%. Моноинфекция, обусловленная ВЭБ встречалась крайне редко, была установлена у пяти человек (2%) молодого возраста (от 25 до 32 лет).

Была выявлена положительная корреляция уровня антител герпесвирусов (сумма индексов позитивности) от возраста (р=0,05; rτ=0,37). Таким образом, возраст являлся предрасполагающим фактором формирования микстформ герпесных инфекций.

При проведении анализа изменения параметров клеточного звена иммунной системы при сочетанном инфицировании ВЭБ с ЦМВ и/или ВПГ 1/2 выявлено достоверное снижение относительного содержания лимфоцитов в группе пациентов с ХИВЭБ и наличием серологических маркеров ЦМВ относительно групп пациентов с наличием антител к ВПГ 1/2.

У пациентов с ХИВЭБ при наличии IgG к ЦМВ количество лимфоцитов составило (22,5 [19,5; 26,5]) % и не выходило за пределы референтного интервала − 19÷37 %.

Полученные данные указывают на тенденцию к относительному лимфоцитозу среди пациентов с серологическими маркерами ВПГ 1/2 типов. У 30% обследованных пациентов с ХИВЭБ и наличием серологических маркеров ВПГ 1/2 был выявлен относительный лимфоцитоз, что указывает на активное влияние ВПГ 1/2 на иммунную систему (рис. 3).


*

ВЭБ+ВПГ1/2

ВЭБ+ЦМВ

ВЭБ+ВПГ1/2+ЦМВ

* − различия достоверны при р<0,05


Рис. 3. Относительное содержание лимфоцитов у пациентов с микст инфекцией
Результаты исследований не показали взаимосвязи между наличием микстинфекции и субпопуляционным составом лимфоцитов.

Содержание в сыворотке крови и спонтанная продукция IFN-α не превышали 50 мг/мл, и достоверно не различались у пациентов с различными формами герпесной микстифекции.

Индуцированная продукция IFN-α в группе пациентов с наличием антител к трем герпесвирусам составляла (86 [50; 198]) пг/мл и была больше, чем при герпесном микстинфицировании, обусловленном двумя вирусами: ВЭБ и ЦМВ − (17 [14; 157]) пг/мл; ВЭБ и ВПГ − (63 [2; 198]) пг/мл, однако достоверных различий не выявлено.

При оценке уровня IFN- у пациентов с микстинфекцией были выявлены достоверные различия показателей спонтанной продукции IFN-. Спонтанная продукция IFN-, отражающая преактивацию мононуклеаров персистирующими вирусами, при наличии антител к трем герпесвирусам составила (76 [37; 159]) пг/мл и была выше установленного референтного интервала.

У пациентов с ХИВЭБ в сочетании с антителами к ЦМВ или ВПГ 1/2 эта преактивация была незначительной и не проявлялась повышением спонтанной продукции IFN-.

У пациентов с ХИВЭБ и наличием антител к ЦМВ отмечались наименьшие показатели индуцированной продукции IFN- − (374 [247; 385]) пг/мл (р<0,05).

Таким образом, на основании проведенных исследований охарактеризованы механизмы иммунной защиты у пациентов при различных фазах ХИВЭБ и выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей, которые вошли в алгоритм диагностики ВЭБ-инфекции (рис. 4).

Рис. 4. Алгоритм лабораторной диагностики ВЭБ-инфекции.

Выводы


  1. У пациентов с хронической ВЭБ-инфекцией достоверно чаще выявляются антитела класса IgG к нуклеарным EBNA-1 и капсидным белкам VCA (92% и 88%, соответственно); а антитела IgG к ранним антигенам EA – в 10% случаев. Специфический гуморальный иммунный ответ на хроническую ВЭБ-инфекцию в 71% случаев представлен VCA+EBNA-1; 12% – EBNA-1; 10% – VCA+EBNA-1+EA; 7% – VCA.

  2. Использование метода иммуноблоттинга позволило в два раза чаще выявлять антитела к ранним антигенам, по сравнению с традиционным методом ИФА, при этом частота обнаружения ядерных и капсидных белков разными методами анализа была сопоставимой.

  3. Методом иммуноблоттинга среди пациентов с профилем антител класса G к VCA в 80% случаев была установлена активация хронической ВЭБ-инфекции, которая характеризовалась наличием антител IgG к gp125 и соотношением gp125/p22>1.

  4. Особенностью хронической персистирующей инфекции, характеризующейся специфическим гуморальным иммунным ответом, представленным антителами IgG к VCA+NA, является уменьшение абсолютного и относительного содержания NK-клеток и выраженное снижение продукции IFN-α, имеющие значение для определения тактики иммунотерапии.

  5. При обострении хронической ВЭБ-инфекции, когда соотношение вирусных белков VCA gp125/p22>1, наблюдается активация Т-клеточного звена, проявляющаяся в увеличении абсолютного количества зрелых Т-лимфоцитов и спонтанной продукции IFN-.

  6. Реактивация хронической ВЭБ-ассоциированной инфекции, которая характеризуется наличием антител класса G к VCA+NA+EA, отличается достоверным снижением в периферической крови клеток с киллерной активностью – CD3+CD8+ и CD3-CD(16+56)+.

  7. Частота распространения IgG к ВПГ 1/2 и ЦМВ среди пациентов с хронической инфекцией, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр составляет 98% и увеличивается с возрастом. При хронической микстинфекции, вызванной ВЭБ и ЦМВ отмечается значительное снижение индуцированной продукции IFN-.



Практические рекомендации


  1. Для получения полноценной информации при клинико-лабораторной диагностике и дифференцировке стадий ХИВЭБ рекомендуется применять следующие подходы:

- на этапе определения наличия инфицирования ВЭБ использовать чувствительные методики (определение IgG к VCA и IgG к EBNA-1 методом ИФА);

- на этапе дифференцировки стадий ХИВЭБ использовать наиболее специфичные методики (IgG к отдельным антигенам ВЭБ методом ИБ).



  1. Использование показателей IFN в комбинации (содержание в сыворотке, спонтанная продукция, индуцированная продукция) позволяет оценить напряженность системы интерферонов при ХИВЭБ.

  2. На основании выявленных особенностей показателей специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при ХИВЭБ, с учетом взаимосвязи различных звеньев иммунитета, а также возможностью использования метода ИБ были выделены наиболее информативные лабораторные показатели, которые вошли в алгоритм диагностики и дифференцировки стадий ХИВЭБ.


список работ, опубликованных

по теме диссертации
Статьи в научных изданиях по перечню ВАК Минобрнауки РФ


  1. Горейко Т.В. Использование метода иммуноблотинга в диагностике хронической инфекции вируса Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. – 2010. − №3. – С. 58-61.

  2. Горейко Т.В. Комплексное изучение показателей специфического иммунного ответа и интерферонового статуса у пациентов с длительным субфебрилитетом, обусловленным вирус Эпштейна-Барр инфекцией / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Российский аллергологический журнал. − 2010. − №1, вып.1. – С 51-52.

  3. Горейко Т.В. Роль цитокинов в патогенезе хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина // Цитокины и воспаление −2011. − №4 – С. 50-54.


Статьи, тезисы докладов и статей


  1. Горейко Т.В. Оценка информативности метода иммуноблотинга в диагностике вируса Эпштейна-Барр инфекции // Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых 22.04.2010 г. – Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2010. – С. 203-204.

  2. Горейко Т.В. Возможности диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Лаборатория. − № 2. – 2010. – С. 29.

  3. Горейко Т.В. Современные представления об иммунопатогенезе инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр // Т.В. Горейко, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина // Инфекция и иммунитет. – Т.1, №2. – 2011. – С. 121-130.

  4. Горейко Т.В. Влияние структуры герпес-вирусного микстинфицирования на показатели иммунного ответа / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых 24.05.2011 г. − Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2011. – С. 27-29.

  5. Goreyko T.V. Interrelation between the cellular and specific humoral immune response in patients with a chronic Epstein−Barr virus infection / Т.V. Goreyko, L.B. Drygina // Abstract of First European Joint Congress of EFCC and UEMS «Laboratory Medicine in Health Care», 13-16 October 2010, Lisbon, Portugal . –P. 50.

  6. Goreyko T.V. Chronic Epstein-Barr Virus infection in association with Herpes Simplex Virus types 1 and 2, Human Cytomagalovirus / Т.V. Goreyko, L.B. Drygina // Abstract of 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 15-19 May 2011, Berlin, Germany. – P. 522.



Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница