Организация и проведение мероприятий против крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов россии



Скачать 254.39 Kb.
страница4/7
Дата01.05.2016
Размер254.39 Kb.
ТипМетодические рекомендации
1   2   3   4   5   6   7

8.9.5. Для обеззараживания выделений больного, содержащих кровь (рвотные массы, кал, моча), белья, предметов, загрязненных выделениями больных, используют 3-5% растворы карболовой кислоты, хлорамина, лизола. Выделения больного засыпают хлорной известью на 2 ч.

8.9.6. Посуду больного обеззараживают кипячением.

8.9.7. В палатах следует постоянно проводить текущую обработку полов, стен, дверей 3% раствором хлорамина или 6% раствором перекиси водорода. Постельные принадлежности (одеяла, матрацы, подушки) подлежат камерной обработке после выписки больного. Вещи, не подлежащие обработке в камере, следует замачивать в 3-5% растворе лизола или хлорамина на 2 часа.

8.9.8. За медицинским персоналом устанавливается медицинское наблюдение с ежедневным термометрированием.
8.10. Патологоанатомическое исследование трупа
8.10.1. При наличии анамнеза, клинических данных и серологического исследования сыворотки крови, подтверждающего КГЛ, труп с учетом высокого риска заражения персонала вскрытию не подлежит.

8.10.2. При наличии анамнестических и клинических симптомов КГЛ без подтверждения диагноза лабораторными исследованиями (серологические исследования парных сывороток, вирусологические исследования крови) труп подлежит патологоанатомическому вскрытию с применением средств индивидуальной защиты (противочумный костюм I типа) и мер личной безопасности в соответствии с требованиями "Инструкции по проведению первичных мероприятий при выявлении больного (трупа), подозрительного на заболевание чумой, холерой, контагиозными вирусными геморрагическими лихорадками" (Москва, 1985) под наблюдением специалиста противочумного учреждения или специалиста по особо опасным инфекциям центра Госсанэпиднадзора. При этом наиболее отвечает требованиям биологической безопасности метод вскрытия in situ (на месте) без извлечения органов из полостей трупа. В этом случае инфицированная кровь, содержимое органов и полостей стекают в грудную и брюшную полости трупа, уменьшая возможность загрязнения окружающих предметов и персонала.

8.10.3. Для серологического и вирусологического исследований берут кровь из сердца, кусочки легких, печени, селезенки, почек. Направление для исследования секционного материала оформляют в соответствии с образцом (приложение 6).

8.10.4. Перевозка трупа и его захоронение осуществляются в соответствии с требованиями выше указанной инструкции в присутствии специалиста противочумного учреждения или специалиста по особо опасным инфекциям центра Госсанэпиднадзора.
9. Лабораторная диагностика Крымской

геморрагической лихорадки
9.1. Отбор проб и транспортировка биологического

материала от людей (трупов)
Организация отбора проб и транспортировка биологического материала от людей (трупов) при регистрации спорадических случаев и вспышек Крымской геморрагической лихорадки осуществляются в соответствии с требованиями СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности" и СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности".

Лабораторная диагностика КГЛ проводится вирусологическими, серологическими и молекулярно-биологическими методами.

Отбор проб биологического материала от больных и подозрительных на КГЛ осуществляет медицинский персонал с соблюдением требований противоэпидемического режима (во избежание внутрибольничных вспышек). Необходимо использование защитного костюма, перчаток, маски и очков. Кровь, взятая у больных в острой стадии заболевания, может содержать вирус в высоких концентрациях, что диктует необходимость дезинфекции пробирок, шприцев, игл и другого лабораторного оборудования немедленно после использования. Использованные для отбора шприцы, пробирки, стеклянные палочки, пипетки погружают в раствор дезинфектанта: 3% раствор хлорамина или 6% раствор перекиси водорода на 1 час.

9.1.1. Отбор проб для вирусологического исследования

Объектами исследования служат:

- кровь;

- секционный материал: печень, легкие, селезенка, почки, мозг (головной и спинной).

Кровь отбирают, соблюдая правила асептики, из локтевой вены в количестве 5 мл в острый период болезни (первые 5-7 дней). Над пламенем спиртовки кровь переносят в пробирку с плотно закрывающейся (завинчивающейся) пробкой. Пробирка этикетируется. Этикетка делается из лейкопластыря и наклеивается на пробирку или ампулу. На этикетке указываются фамилия, имя, отчество больного, вид материала, дата отбора.

Для отбора секционного материала вскрытие умерших от КГЛ, а также подозрительных на данную инфекцию, производит патологоанатом или судмедэксперт в присутствии специалиста по этим инфекциям (эпидемиолога или инфекциониста).

Из глубины внутренних органов (сердце, печень, легкие, селезенка, почки, головной мозг) стерильно вырезают кусочек ткани размерами 2-3 см. Стерильной пастеровской пипеткой с резиновой грушей забирают 8-10 мл крови из сердца. Следует отбирать материал из нескольких участков, подвергшихся изменениям, и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание обращают на пограничную зону. Отбор секционного материала необходимо производить как можно быстрее после смерти больного (не более 20 часов нахождения при комнатной температуре).

Секционный материал следует отбирать в соответствии с п. 8.10.2. Отобранный материал помещают в стерильные пробирки с плотно закрывающимися (завинчивающимися) пробками, этикетируют, завязывают и опускают в емкость для транспортировки, оставляя снаружи концы завязок с этикеткой.

Все манипуляции с кровью проводят в ватно-марлевой маске и резиновых перчатках.

Запрещается проводить следующие манипуляции.

- центрифугирование,

- встряхивание,

- пипетирование ртом.

Для вирусологического исследования консерванты не добавляют, и инактивация материала не проводится.

Каждая проба сопровождается направлением. Бланки направлений представлены в приложениях 6 и 7.

9.1.2. Отбор проб для серологической диагностики

Объекты исследования:

- кровь;

- секционный материал.

Кровь отбирают дважды - на 5-7 и на 10-14 дни от начала заболевания.

Кровь у больного отбирают из локтевой вены в стерильную пробирку в количестве 5-10 мл, соблюдая правила асептики. Для предотвращения гемолиза сыворотку следует отделить от сгустка. Для этого пробирку с кровью оставляют в термостате при комнатной температуре в скошенном положении, затем образовавшийся сгусток крови обводят стеклянной палочкой и помещают в холодильник при температуре 4 град. С на 10 часов. Полученную сыворотку отсасывают пипеткой с резиновой грушей в пластиковую пробирку, герметично закрывают и направляют в лабораторию для исследования на наличие специфических антител к вирусу КГЛ Конго. Если нет пластиковой пробирки, используют стерильные пенициллиновые флаконы. Сгусток сохраняется в пробирке только при первом заборе и может быть использован для вирусологического и молекулярно-генетического исследований.

Сыворотку крови хранят в стерильных пробирках или в ампулах при температуре +4 град. С.

Каждая проба сопровождается направлением. Бланк направления представлен в приложении 8.

9.1.3. Отбор проб для клинического исследования

Биологический материал для клинического лабораторного исследования у больных с подозрением на КГЛ представляет опасность для лабораторных работников, а многие методики исследования этого материала затрудняют соблюдение надежного противоэпидемического режима. В этих случаях клинические лабораторные исследования следует ограничить. Взятие проб крови в остром периоде должно производиться в необходимом количестве однократно.
9.2. Транспортировка крови и сыворотки в

вирусологическую лабораторию
Для передачи в вирусологическую лабораторию в первичной герметично закрывающейся таре пробы помещают во вторичную тару, представляющую собой герметичный металлический или пластиковый пенал.

Транспортировать материал для вирусологического исследования следует в жидком азоте (сосуде Дьюара). Можно пользоваться термосом с сухим льдом.

Биологический материал от первых больных (трупа) с подозрением на КГЛ отправляется в вирусологическую лабораторию в течение 24 часов.

Отобранный материал с направлением доставляется в специализированную лабораторию (в соответствии со схемой доставки материала). Транспортировка материала осуществляется специально выделенным транспортом в сопровождении медицинского работника.
9.3. Подготовка сыворотки для серологического

исследования
При исследовании сывороток необходимо соблюдать меры предосторожности и обращаться с ними как с материалом, подозрительным на заражение возбудителями I-II групп патогенности.

При поступлении сывороток в лабораторию работу с ними проводят в боксе в противочумном костюме I типа. Вскрывают бикс, проверяют правильность оформления направления, целостность и герметичность пробирок с сыворотками. Бикс обрабатывают 3% раствором хлорамина или 6% раствором перекиси водорода.

Сыворотки инактивируют на водяной бане в течение 45 мин. при температуре 56 град. C с добавлением мертиолата натрия 1:10000. До исследования сыворотки хранят при температуре 4 град. С.

Работу проводят в боксе в костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками.

Результаты анализов оформляют в соответствии с образцом (приложение 9).
9.4. Ранняя диагностика Крымской геморрагической

лихорадки методом иммуноферментного анализа

(определение IgM антител)
9.4.1. Сокращения в тексте:

ИФА - иммуноферментный анализ;

ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер с твином;

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер;

ЦФБ - цитратно-фосфатный буфер;

ОФД - орто-фенилендиамин.

9.4.2. Лабораторное оборудование, реактивы, материалы

9.4.2.1. Оборудование:

- планшеты или стрипы для проведения ИФА из полистирола с плоским дном производства НИИ "Медполимер" (г. Москва);

- пробирки для микропроб объемом 0,5 и 1,5 мл;

- дозаторы пипеточные одноканальные и многоканальные;

- центрифуга лабораторная;

- pH-метр любой марки;

- холодильник бытовой любой марки;

- термостат на 37 град. С любой марки;

- весы торзионные;

- лабораторная стеклянная посуда: пробирки, градуированные и пастеровские пипетки, колбы, мерные цилиндры.

9.4.2.2. Реактивы:

- натрий углекислый, хч;

- натрий двууглекислый, хч;

- натрий хлористый, хч;

- натрий фосфат однозамещенный, хч;

- натрий фосфат двузамещенный, хч;

- лимонная кислота, хч;

- орто-фенилендиамин;

- бычий сывороточный альбумин;

- твин-20;

- перекись водорода 30%, хч;

- кислота серная, хч;

- вода дистиллированная.

9.4.2.3. Материалы:

- антитела козьи, очищенные против мю-цепей иммуноглобулинов М человека фирмы Sigma-Aldrich;

- конъюгат специфических антител мыши против вируса КГЛ Конго с пероксидазой хрена;

- антиген вируса КГЛ сахарозо-ацетоновый или культуральный;

- антиген "нормальный", приготовленный из мозговой ткани незараженных мышей-сосунков или незараженной культуры клеток;

- контрольная положительная сыворотка крови человека;

- контрольная отрицательная сыворотка крови человека.

9.4.3. Методика выполнения иммуноферментного анализа

9.4.3.1. Сенсибилизация планшетов

В лунки полистиролового планшета или стрипов вносят по 0,1 мл раствора козьих антител против мю-цепей IgM человека фирмы Sigma-Aldrich в концентрации 5-10 мкг/мл в 0,05 М КББ pH 9,6. Планшеты оставляют во влажной камере на 2 часа при температуре 37 град. С или при 4 град. С на ночь. Неадсорбированные иммуноглобулины отмывают 3 раза 0,01 М ФСБ pH 7,4 с 0,1% твина-20.

9.4.3.2. "Забивка" альбумином активных центров планшетов

Для предотвращения неспецифического связывания компонентов ИФА-диагностикума или крови больного с полистиролом производят обработку сенсибилизированных планшетов или стрипов 1% раствором БСА на ФСБ-твине. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 мл раствора БСА и выдерживают планшеты (стрипы) 1 час при 37 град. С. После чего раствор БСА вытряхивают и планшеты подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге, помещают в полиэтиленовый пакет и хранят до использования при 4 град. С не более 2 недель. Возможно более длительное хранение при -20 град. С до 3-х месяцев.

9.4.3.3. Внесение контрольных и исследуемых сывороток

Для этого перед исследованием делают разведения сывороток, начиная с разведения 1:100 на ФСБ-Т-БСА, и вносят в соседние лунки сенсибилизированного планшета по 0,1 мл, по две лунки на каждое разведение сыворотки. Контрольные положительную и отрицательную сыворотки разводят ФСБ-Т-БСА до титра, указанного на этикетке, и вносят по 0,1 мл в соседние лунки планшета: две лунки для положительной сыворотки и две лунки для отрицательной сыворотки. Положительные и отрицательные контроли необходимо делать на каждом планшете! Инкубацию сывороток проводят во влажной камере 1,5-2 часа при 37 град. С. Несвязавшиеся компоненты сывороток удаляют из лунок и трехкратно промывают ФСБ-Т.

9.4.3.4. Внесение антигенов

Делают рабочие разведения (указаны па этикетке) антигена вируса КГЛ и "нормального" антигена на ФСБ-Т-БСА и вносят по 0,1 мл антигена вируса КГЛ в нечетные ряды планшета и по 0,1 мл "нормального" антигена в четные ряды планшета. Инкубацию антигенов проводят 1 час при 37 град. С или в ночь при 4 град. С. Несвязавшийся антиген удаляют, лунки планшета промывают 3 раза ФСБ-Т.

9.4.3.5. Внесение конъюгата специфических антител мыши против вируса КГЛ Конго с пероксидазой хрена (конъюгат)

Делают рабочее разведение конъюгата (указано на этикетке) на ФСБ-Т-БСА и вносят по 0,1 мл во все лунки планшета. Инкубацию конъюгата проводят при 37 град. С в течение часа. Несвязавшийся конъюгат удаляют встряхиванием, лунки планшета промывают 5 раз.

9.4.3.6. Внесение субстрат-индикаторного раствора

Для приготовления субстрат-индикаторного раствора в готовом ЦФБ растворяют 6 мг ОФД и добавляют 20 мкл 3% раствора перекиси водорода.

Приготовленный раствор немедленно вносят по 0,1 мл в каждую лунку планшета и оставляют при комнатной температуре в темноте. Через 5-20 минут ферментную реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,05 мл 2Н раствора серной кислоты.

9.4.4. Учет результатов реакции

Учет результатов реакции проводят спектрофотометрически на приборе мультискан при длине волны 492 нм или визуально. Положительной считается сыворотка, имеющая оптическую плотность, превышающую в 2,1 раза в лунке с антигеном КГЛ по отношению к оптической плотности в лунке с "нормальным" антигеном. При этом оптическая плотность в лунках с "нормальным" антигеном не должна превышать 100 оптических единиц (показатель прибора 0,1). При визуальном учете лунки с антигеном КГЛ должны четко отличаться от лунок с "нормальным" антигеном. При этом лунки с "нормальным" антигеном должны иметь едва заметное желтое окрашивание.
9.5. Оценка результатов лабораторной диагностики КГЛ

на основании обнаружения специфических антител

классов M и G в сыворотках крови

больных и выздоравливающих
9.5.1. Для постановки диагноза КГЛ на основе выявления специфических антител класса M достаточно обнаружить в одной сыворотке IgM в титре не менее 1:800. Если в ранней сыворотке крови IgM определены в титре менее чем 1:800, то ставят диагноз КГЛ под вопросом и исследуют повторную сыворотку крови. При этом больного "ведут" с соблюдением всех мер предосторожности. IgM появляются на 5-7 день от начала заболевания, максимальные титры (1:20000 и более) выявляются на 2-3 неделе, а к 90 дню IgM, как правило, обнаруживаются в невысоких титрах или не определяются совсем.

9.5.2. Для постановки диагноза КГЛ на основе выявления антител класса G необходимо исследовать одновременно парные сыворотки крови.

Например, в 1-й сыворотке крови, взятой на 2-й день заболевания, титр антител менее 1:100, а во 2-й сыворотке, взятой на 10-й день заболевания, титр антител 1:200. Это означает, во-первых, появление антител, а, вo-вторых, увеличение титра. Диагноз подтверждается.

Если в первой сыворотке крови титр антител 1:100, то диагноз можно поставить только при обнаружении во второй сыворотке титра антител 1:400 и более.

Если титр антител во второй сыворотке не изменился, то можно предположить наличие анамнестических антител. Чтобы окончательно снять диагноз в этом случае, необходимо провести поиск IgM-антител.

Специфические IgG появляются на 7-10 день от начала заболевания, достигают пика к концу второго месяца, держатся в высоких титрах 6-8 месяцев. К концу первого года титр IgG снижается, и невысокие титры у некоторых больных держатся годами. У части больных к концу первого года G антитела исчезают из периферической крови совсем.

9.5.3. При обнаружении IgM в титре 1:800 и более и IgG в любом титре диагноз считается подтвержденным.

При необходимости в научно-исследовательских учреждениях создается банк положительных и отрицательных сывороток.
9.6. Реакция объемной агломерации (РАО) с полимерным

диагностикумом сухим для обнаружения антител

к вирусу КГЛ Конго
Тест-система для выявления антител к вирусу КГЛ Конго геморрагической лихорадки представляет комплект, состоящий из 96-луночной планшеты для иммунологических реакций, флаконов с лиофильно высушенным диагностикумом КГЛ Конго антигенным полимерным, позитивной сывороткой 1:10, нормальной кроличьей сывороткой и флакона с 0,9%-ным раствором хлорида натрия (pH 7,0-7,2) для разведения лиофильно высушенных реагентов.

9.6.1. Приготовление ингредиентов для РАО

Нормальную кроличью сыворотку из флакона с одноименным наименованием в количестве 50 мкл (0,05 мл) разливают в лунки 96-луночной планшеты для иммунологических реакций.

Для приготовления рабочего разведения диагностикума полимерного антигенного КГЛ Конго содержимое флакона с одноименной маркировкой растворяют в 2,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (pH 7,0-7,2) из прилагаемого флакона.

Для постановки положительного контроля из флакона с маркировкой "Контрольная позитивная сыворотка" (в ампуле сыворотка в разведении 1:10) берут 50 мкл и титруют в разведениях 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280.

9.6.2. Подготовка исследуемых сывороток

Исследуемую сыворотку обеззараживают раствором мертиолата натрия в разведении 1:1000. Для этого к сыворотке добавляют раствор мертиолата натрия до конечной концентрации 1:10000. Исследуемую сыворотку человека перед определением уровня антител разводят 0,9%-ным свежеприготовленным раствором хлорида натрия в 20 раз следующим образом: берут 0,1 мл исследуемой сыворотки и 1,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия.

Разведенную сыворотку прогревают в течение 30 мин. в водяной бане или инактиваторе при температуре 56 град. С. После этого сыворотку оставляют при 20 (+/- 2) град. С на 10 мин. и затем исследуют в РАО.

9.6.3. Методика проведения РАО

В "U"-образные лунки планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл приготовленной разводящей жидкости автоматической пипеткой или пипеткой-капельницей из микротитратора типа Такачи. Исследуемую сыворотку в количестве 50 мкл вносят в первую лунку ряда пипеткой-дозатором и готовят двукратные последовательные разведения. Рекомендуется титровать каждую исследуемую пробу в разведениях 1:80, 1:160, 1:320. Затем в каждую лунку добавляют пипеткой-капельницей по 25 мкл суспензии диагностикума в рабочем разведении. После добавления диагностикума содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 мин. и оставляют при температуре не выше 25(+/- 2) град. С на 1,5-2 ч.

Для контроля диагностикума на спонтанную агломерацию в 2-3 лунки вносят только разводящую жидкость и диагностикум.

9.6.4. Оценка результатов лабораторной диагностики КГЛ на основании обнаружения специфических антител в крови больных

Каталог: docs -> epidemiology
epidemiology -> Методические рекомендации профилактика и лечение сопутствующих заболеваний (туберкулеза, вирусных гепатитов и иппп) у взрослых
epidemiology -> Обязательные условия применения рекомендаций
epidemiology -> Методические рекомендации организация профилактики вич-инфекции среди различных групп населения
epidemiology -> Общая характеристика химических веществ
epidemiology -> Методические рекомендации мониторинг и оценка эффективности мероприятий по профилактике и лечению вич-инфекции
epidemiology -> Методические рекомендации о проведении поведенческого надзора среди больных вич-инфекцией
epidemiology -> Это область медицины, которая изучает законы взаимодействия живого организма и яда
epidemiology -> Вакцинация как составляющая часть национального проекта "здоровье"


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7


База данных защищена авторским правом ©zodorov.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница